Celulases

No ecossistema típico de degradação de celulose muitas bactérias e fungos celulolíticos atuam com microrganismos relacionados para converter substratos celulósicos insolúveis em açúcares solúveis – principalmente celobiose e glicose, que são então assimilados pela célula. Sistemas de enzimas múltiplos são assim requeridos para degradar eficientemente a celulose. Tais sistemas abrangem ou uma coleção de celulases livres e/ou complexos multicomponentes chamados celulosomas (BAYER et al., 1998).

Segundo Bhat e Bhat (1997), as celulases têm sido utilizadas na indústria têxtil para remoção do excesso de corante do tecido denim no pré-desbotamento do jeans azul; remoção de microfibrilas salientes dos tecidos de algodão depois de vários ciclos de lavação; reconstituição da maciez e brilho da cor nos tecidos de algodão. Enquanto segundo Cavaco- Paulo (1998) e Andreaus (2001), as celulases têm o uso aumentado na indústria têxtil, principalmente no acabamento e lavação. Conforme a atividade e o pH, as celulases podem ser classificadas em: i) ácidas, cujo pH de atuação varia entre 4,5 e 5,5 e a temperatura entre 45-55ºC; ii) neutras pH 5,5-8,0 e temperatura 50-60ºC e iii) alcalinas que são utilizadas em detergentes. A mistura de celulases ácida e neutra é conhecida como celulase “híbrida”. Nestes processos é sempre empregada forte ação mecânica nos tecidos. O nível de agitação mecânica aumenta a perda de massa do tecido e afeta diferentemente as atividades relativas da

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endoglucanase (EG) e celobiohidrolase (CBH) na mistura bruta total. Esta é a chave para o entendimento dos mecanismos pelos quais os efeitos causados pelas celulases são obtidos.

Independente da classificação, as celulases catalisam a hidrólise e a degradação da celulose, causando diferenças importantes nas propriedades macroscópicas dos tecidos tratados como perda de massa, diminuição do grau de polimerização, e consequentemente a perda da resistência à tração. Por isso, se faz necessário o conhecimento e controle de todos os parâmetros, para evitar tratamentos excessivos ou indevidamente controlados que ocasionem severos danos aos tecidos e, portanto prejuízos econômicos (ANDREAUS, 2001).

Os diferentes modos de ação das enzimas celulolíticas sobre o substrato polimérico são comumente descritas como ataques do tipo endo e exo. As celulases são multicomponentes, ou seja, são misturas de três diferentes tipos de enzimas que atuam em sinergismo, na degradação da celulose a até glicose: a endoglucanase (EG, b-(1,4)-D-glucana 4–glucano hidrolase, E.C. 3.2.1.4), a celobiohidrolase (CBH, b-(1,4)-D-glucana celobiohidrolase, E.C. 3.2.1.91) e celobiase (bG, b-(1,4)-glicose, E.C. 3.2.1.21). Existem ainda as exoglucanases (EGX, b-(1,4)-D-glucana celobiohidrolase, E.C. 3.2.1.74), que existem em poucos sistemas celulolíticos e não interagem sinergisticamente com as outras celulases. A degradação do polímero de celulose é realizada pela ação das celulases multicomponentes que atuam em sinergia. A Tabela 2.2 apresenta os componentes da celulase de fungos aeróbios e seu modo de ação na cadeia celulósica e o grau de sinergismo é apresentado na Tabela 2.3. Verifica-se que a atividade relativa, quando os grupos de enzimas atuam de maneira isolada, é bastante baixa e quando os três grupos atuam em conjunto, permitem a hidrólise total da celulose. O esquema de atuação das enzimas do complexo celulase sobre a estrutura da celulose é apresentado na Figura 2.2 (TEERI, 1997; CAVACO- PAULO, 1998; ABRAHÃO NETO, 2001; ANDREAUS, 2001; MIZUTANI et al., 2002).

Segundo Andreaus (2001), o procedimento geral para a aplicação de celulases, em bioestonagem, deve seguir os seguintes passos: introduzir os artigos de fibras de celulose na máquina; ajustar as condições operacionais, como pH e temperatura; adicionar a enzima; controle do tempo, temperatura, pH e agitação mecânica durante o processamento; interromper a atuação da enzima (enzyme stop) pela adição de carbonato de cálcio (Na2CO3) e/ou aumento de temperatura a 80ºC durante 10 minutos; lavagem final com detergente.

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Tabela 2.2. Componentes de celulase de fungos aeróbios e seu modo de ação na cadeia celulósica.

Enzima Sinônimo Modo de Ação/Produtos

Endo-b-(1-4)-D- glucanase EG (E.C. 3.2.1.4) Endo-b-(1-4)-glucosidase; b-(1-4)-glucano hidrolase; Endoglucanase; Endocelulase; Carboximetilcelulase (CMCase) ou Celulase Cx.

Quebra as ligações internas nas regiões amorfas, de forma

aleatória, liberando celo- oligossacarídeos com diferentes

graus de polimerização e celobiose. Também libera terminais livres para a ação da

exoglucanase. Exo-b-(1-4)-D-glucanase CBH (E.C. 3.2.1.91) Exo-b-(1-4)-glucosidase; b-(1-4)-glucano celobiohidrolase; Celobiohidrolase; Exocelulase; Avicelase ou Celulase C1. Liberam a celobiose da extremidade não reduzida e

podem também atuar na celulose cristalina. Exo-b-(1-4)-D- glucosidase EGX (E.C. 3.2.1.74) Exoglucosidase ou b-(1,4)-D-glucan- glucohidrolase

São ativas na celulose cristalina. Hidrolisam a celulose, no terminal não reduzido, produzindo polímeros

de glicose. b-glucosidase bG (E.C. 3.2.1.21) b-(1-4)-glicose Celobiase

Libera glicose da celobiose e celo-oligossacarídeos de cadeia

curta (celodextrinas).

FONTE: BHAT e BHAT, 1997; DA-SILVA et al., 1997.

Tabela 2.3. Atividades relativas de celulases de Trichoderma koningi sobre a hidrólise completa de celulose de algodão.

Enzima Atividade Relativa Enzima Atividade Relativa

EG < 1% CBH + βG 4% CBH < 1% EG + CBH + βG 103% βG Nenhuma EG + βG 5% Caldo de cultura inicial 100%

FONTE: ABRAHÃO NETO, 2001.

Muitos estudos foram realizados nos sistemas de celulase de fungos aeróbios Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Penicillium pinophilum, Sporotrichum pulverulentum, Fusarium solani, Talaromyces emersonni e Trichoderma koningii. Também foram identificados outros microrganismos produtores de celulase ativa tais como os fungos aeróbios termofílicos (Sporotrichum termophile, Thermoascus aurantiacus, Chaetomium

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thermophile, Humicola insolens), fungos anaeróbios mesofílicos (Neocallimastix frontalis, Piromonas communis, Sphaeromonas communis) bactérias aeróbias mesofílicas e termofílicas (Acetovibrio cellulolyticus, Bacteróides succionogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens e Clostridium thermocellum). Dentre estes microrganismos, os termofílicos celulolíticos são os mais interessantes, pois as celulases são geralmente estáveis sob uma variedade de condições severas incluindo pH altamente ácido e alcalino, bem como temperaturas superiores a 90ºC (BHAT e BHAT, 1997).

Figura 2.2. Atuação das enzimas multicomponentes da celulase na estrutura da celulose.

FONTE: Adaptação de ANDREAUS, 2001.

As celulases mais estudadas e usadas são produzidas por fungos como Aspergillus niger, Humicola insolens, Penicillium funiculosum e Trichoderma reesei e são enzimas extracelulares, o que facilita a obtenção industrial por fermentação (ANDREAUS, 2001).

A maioria das celulases fúngicas é constituída por dois domínios: um grande domínio catalítico e um pequeno domínio de ligação à celulose (Cellulose Binding Domain – CBD). O domínio catalítico é o local em que ocorre a hidrólise das cadeias de celulose, ou seja, é o centro ativo que atua sobre o substrato. A catálise de hidrólise das ligações glicosídicas b-(1,4)-D está associada à presença de grupos aminoácidos como o aspartato ou glutamato. O CBD estabelece a ligação com o substrato via ligações hidrófobas e interação de

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Van der Waals. É essencial a atividade na celulose cristalina, apesar de possuir atividade própria de hidrólise, mas interage sinergisticamente com o domínio catalítico. A ligação do CBD com o domínio catalítico é realizada por um polipeptídio, conhecido como linker. O linker é responsável pela flexibilidade dos dois domínios. Podem ser citadas como celulases que não possuem CBD e linker, a EG III do Trichoderma reesei e a EG I, EG III e EG VI do Humicola insolens. A presença de CBD é essencial para a degradação da celulose cristalina sólida. A remoção do CBD tipicamente resulta na diminuição de aproximadamente 50-80% da atividade da celulase fúngica sobre os substratos insolúveis, mas não nos solúveis (ANDREAUS, 2001; HEIKINHEIMO et al., 2000).

A adição de celulases totais ao banho de biopurga tem demonstrado o aumento da eficiência de pectinases e de xilanases. Acredita-se que as celulases eliminam as impurezas indesejáveis pela hidrólise da celulose subjacente, porém a esse mecanismo, o dano típico das celulases às fibras pode ocorrer (AXT-MARTINELLI, 2002).