flagrans
RESUMO
A visualização da interação do nematóide com o fungo em diferentes momentos de atividade de Duddingtonia flagrans, é de fundamental importância em uma pesquisa, pois objetiva constatar e comprovar as hipóteses do trabalho. Para observação da captura dos trichostrongilídeos pelo fungo nematófago, larvas infectantes com movimentos vigorosos foram selecionadas e inoculadas em placas de petri contendo o fungo D. flagrans e meio ágar-água como substrato. As placas foram posteriormente monitoradas sob microscópio óptico em horários distintos: 1ª, 3ª, 4ª, 5ª, 10ª, 15ª, 20ª e 25ª hora. Os resultados demonstraram que quanto maior o tempo de contato físico do nematóide com o fungo, maior a proporção de destruição das larvas pelas hifas fúngicas, as quais invadiram o corpo do nematóide completamente na 25ª hora. Já nos primeiros momentos de contato físico entre ambos, observou-se que a presença das larvas com seus movimentos sigmóides, suas excretas, dentre outros fatores, fizeram com que o fungo construísse armadilhas em forma de botões e redes adesivas, anéis constritores e não-constritores, a fim de capturar os nematóides trichostrongilídeos. Em todos os momentos de observação da cinética de captura, a 5ª hora de interação foi crucial para a larva, pois as armadilhas de D. flagrans lesaram a cutícula externa do nematóide, ocorrendo um descolamento do seu corpo. Essa estrutura do nematóide é imprescindível tanto para a infecção no animal, como para sua sobrevivência no ambiente, portanto, admite-se que, a partir desse momento, mesmo as larvas permancendo vivas e ativas nos horários de observações subsequentes, na 5ª hora, a larva perdeu seu poder infectante. Na 15ª hora de interação, foi observado que apesar da grande invasividade de hifas fúngicas pelo corpo do nematóide, a larva ainda permaneceu viva, com movimentos ativos, entretanto sequer, nenhuma viabilidade de continuidade de seu ciclo evolutivo. Portanto, embora os resultados dos horários em que ocorreram a destruição total do nematóide pelo fungo sejam de extrema relevância para o conhecimento dos momentos de penetração das hifas no corpo do nematóide, conclui-se que não são necessários tempos exacerbados de interação para que a larva perca sua viabilidade, o que evidencia a grande capacidade de D. flagrans como predador de nematóides.
ABSTRACT
The visualization of the interaction of nematode with fungi at different moments of activity of Duddingtonia flagrans, has a great importance in a research, therefore objective to evidence and to prove the hypotheses of the work. To observe the capture of the trichostrongilídeos for nematophagous fungi, infecting larvae with vigorous movements had been selected and inoculated in petri plates containing fungi D. flagrans and agar-water mean as substratum. After that, the plates had been monitored under optic microscope in distinct hours: 1ª, 3ª, 4ª, 5ª, 10ª, 15ª, 20ª and 25ª hour. The results had demonstrated that the bigger the time of physical contact of nematode with fungi, the greater the ratio of destruction of the larvae by fungal hyphas, which had completely invaded the body of nematodes in 25ª hour. Already at the first moments of physical contact between both, it was observed that the presence of the larvae with its sigmoids movements, its excrements, amongst other factors, had made the fungi build traps in form of buttons and adhesive nets, constricting rings and non-constricting, in order to capture trichostrongilid nematodes. In all the moments of observation of the kinetic of the capture, 5ª interaction hour was crucial for the larvae, therefore the traps of D. flagrans had injured external cuticle of nematode, occurring a deattachement of its body. This structure of nematode is essential in such a way for the infection in the animal, as for its survival in the environment, therefore, it admits that, from this moment, exactly the alive and active larvae remained in the schedules of subsequentes observation, in the 5ª hour, the larvae lost its infecting power. In 15ª interaction hour, was observed that although the great invasivity of fungal hyphas on the body of nematode, the larvae still remained alive, with active movements, however at least, without viability of continuity of its evolutive cycle. Therefore, even so the results of the hours when they had occurred the total destruction of nematode for fungi are of extreme relevance for the knowledge of the moments of penetration of hyphas in the body of nematode, conclude that they are not necessary e times of interaction so that the larvae loses its viability, showing evidences of the great capacity of D. flagrans as predator of nematodes.
5.1 INTRODUÇÃO
As estruturas de predação dos fungos nematófagos são importantes dados a serem constituídos e catalogados, pois reflete na prática o que ocorre natural e fisiologicamente no bolo fecal dos animais. Segundo COOKE; GODFREY (1964), FAEDO et al. (2002), o solo é um excelente ambiente à proliferação de fungos nematófagos, e onde houver matéria orgânica em devida proporção, a probabilidade é ainda maior de ocorrer essa proliferação. Portanto, as fezes constituem um meio rico para a germinação fúngica.
As espécies de fungos nematófagos predadores variam em sua capacidade de capturar nematóides (GRØNVOLD et al., 1996). Produzem armadilhas ao longo de suas hifas, embora muitos desses fungos não as produzam em cultura pura. A diferenciação das hifas podem ocorrer em 24 horas e numerosas estruturas de captura podem ser produzidas (PRAMER, 1964). A formação de armadilhas era atribuída apenas às hifas, mas recentemente, DACKMAN e NORDBRING-HERTZ (1992), relataram que a formação de armadilhas também pode ser atribuída aos esporos. A formação dessas redes estruturais ocorre em resposta à presença de nematóides ou de substâncias deles derivadas e também em condições adversas de cultivo, como escassez de água e/ou nutrientes (BALAN; GERBER, 1972). No ambiente, onde predominam condições estressantes para o desenvolvimento fúngico, a habilidade em predar nematóides os propiciam vantagens adicionais de sobrevivência. Algumas espécies de fungos nematófagos, desenvolvem essas estruturas de captura como resultado à estímulos externos, como citados pelos autores BALAN e GERBER, (1972). Outras, apenas as desenvolvem espontaneamente, sendo as mais dependentes de nematóides como fonte de nutrientes (MOTA et al., 2003). Essas estruturas predatórias do fungo são responsáveis pela sua atividade nematocida.
Portanto, informações ilustrativas que elucidem o que ocorre no percurso de uma pesquisa, são de extrema importância para o entendimento final do trabalho.
5.2 MATERIAL E MÉTODOS
Para permitir a interação do fungo nematófago D. flagrans com larvas infectantes de H. contortus, nematóides gastrintestinais de ovinos em placas de Petri contendo o meio ágar-água 2% foram cultivadas, sendo posteriormente fixadas em glutaraldeído a 2,5%, paraformaldeído a 4%, cloreto de cálcio a 5 mM em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M, pH 7,2.
O monitoramento das interações ocorreu durante 1, 3, 4, 5, 10, 15, 20 e 25 horas, com microscópio óptico sob aumento de 40x e registro fotográfico.
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em relação aos resultados morfológicos do nematóide H. contortus após adição do fungo nematófago D. flagrans, estes foram proporcionais ao tempo de interação entre ambos.
A Figura 5.1 é representada pela presença de esporos de D. flagrans na placa de petri, enquanto que a figura 5.2 demonstra a presença de armadilhas adesivas tridimensionais em resposta à presença de D. flagrans. Com apenas uma hora de interação do fungo, foram observados anéis constritores no nematóide (Figura 5.3), o mesmo ocorrendo com três horas de interação com maior número de redes adesivas ao longo do nematóide (Figura 5.4). Na quarta hora de interação (Figura 5.5), o nematóide ainda encontrava-se com movimentos sigmóides vigorosos apesar da presença das redes adesivas. Com 5 horas de interação, houve um descolamento parcial da cutícula da porção anterior da larva infectante (Figura 5.6). Mesmo esta estando viva e mantendo suas estruturas intactas internas, a dificuldade da sua sobrevivência no ambiente, torna-se completamente comprometida pela perda de parte de sua proteção, diminuindo em grandes proporções as chances de infectar um animal. Com 10 horas de interação entre fungo e nematóide, este ainda encontra-se vivo (Figura 5.7). Entretanto, com 15 horas de interação (Figura 5.8), a região de penetração demonstrou alteração das células de H. contortus. A hifa penetrou a cutícula do nematóide na região anterior de seu corpo demonstrando aparência amorfa, embora a região posterior ainda permanecesse intacta. Já com 20 horas de interação, houve completa ocupação das hifas pelo corpo do nematóide
(Figura 5.9). Na vigésima quinta hora, o mesmo encontrava-se completamente destruído, estando suas estruturas amorfas, sem potencial infectivo (Figura 5.10).
NANSEN et al. (1986), compararam a atividade predatória do isolado Arthrobotrys oligospora sobre larvas infectantes do trichostrongilídeo Cooperia oncophora (L3) e de nematóides de vida livre Rhabditis wohlgemuthi e Panagrellus redivivus. As larvas de Cooperia permaneceram ativas por até 20 horas após serem capturadas nas armadilhas, enquanto os nematóides de vida livre foram rapidamente invadidos e destruídos pelo fungo. Esse fato é devido as larvas infectantes possuírem dupla cutícula remanecentes da muda anterior.
O ponto chave para o discernimento de quando o nematóide não está mais viável para infectar os animais, não é o momento em que as hifas do fungo invadem seu corpo e este encontra-se sem mobilidade, mas sim, o momento em que o nematóide sofra alguma alteração morfológica direta. A cutícula externa, responsável pela manutenção da viabilidade do nematóide, caso injuriada, prejudicaria não somente sua sobrevivência no ambiente como também sua infecção no hospedeiro.
FIGURA 5.1- ESPOROS DE Duddingtonia FIGURA 5.2 – ARMADILHAS ADESIVAS (SETAS)
flagrans IDENTIFICADOS POR SETAS DE Duddingtonia flagrans EM RESPOSTA À
PRESENÇA DE NEMATÓIDES GASTRINTESTINAIS DE OVINOS
FIGURA 5.3 - 1 HORA* FIGURA 5.4 - 3 HORAS*
FIGURA 5.7 - 10 HORAS* FIGURA 5.8 - 15 HORAS*
FIGURA 5.9 - 20 HORAS* FIGURA 5.10 - 25 HORAS*
* :Tempo de contato físico do nematóide Haemonchus contortus aderido à superfície do fungo D. flagrans por meio de substâncias fibrilares adesivas.
Setas: Indicam as constrições realizadas por D. flagrans em presença do nematóide. Figuras: aumento 40x.
5.4 CONCLUSÕES
- O fungo nematófago Duddingtonia flagrans demonstrou ser efetivo no controle de larvas de nematóides gastrintestinais de ovinos, sendo comprovado pelas imagens obtidas;
- Haemonchus contortus, nematóide de maior patogenicidade em pequenos ruminantes, foi completamente destruído pelo referente fungo, sendo portanto, aprovado seu uso como controlador biológico.
REFERÊNCIAS
BALAN, J.; GERBER, N. Attraction and killing of the nematode Panagrellus redivivus by the predacious fungus Arthrobotrys dactiloides. Nematologica, v. 18, p. 163-173, 1972.
COOKE, R. C.; GODFREY, B. E. S. A key of nematode of nematode destroying fungi. Transactions British Mycological Society, Cambridge, v. 47, p. 61-74, 1964. DACKMAN, C.; NORDBRING-HERTZ, B. Conidial traps -a new survival structure of nematode trapping fungus Arthrobotrys oligospora, Mycological Research, v. 96, p.194-198, 1992.
FAEDO, M.; LARSEN, M.; DIMANDER, S. O.; YEATES, G. W.; HOGLUND, J.; WALLER, P. J. Growth of the fungus Duddintognia flagrans in soil surrounding faeces deposited by cattle or sheep fed the fungus as a means of controlling the free- living stages of nematode parasite. Biological Control, Orlando, v. 23, p. 64-70, 2002.
GRØNVOLD, J.; NANSEN, P.; HENRIKSEN, S. A.; LARSEN, M.; WOLSTRUP, J.; BRESCIANI, J.; RAWAT, H.; FRIBERT, L. Induction of traps by Ostertagia ostertagi larvae, chlamydospore production and growth rate in the nematode-trapping fungus Duddingtonia flagrans. Journal of Helminthology, London, v. 70, p. 291-297, 1996.
MOTA, M. A.; CAMPOS, A.K.; ARAÚJO, J. V. Controle biológico de helmintos parasitos de animais: estágio atual e perspectivas futuras. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 23, n. 3, p. 93-100, 2003.
NANSEN, P.; GRØNVOLD, J.; HENRIKSEN, S.A.; WOLSTRUP, J. Predacious ativity of the nematode-destroying fungus, Arthrobotrys oligospora, on preparasitic larvae of Cooperia oncophora and on soil nematode. Proceedings of the helminthologiacal Society of Washington, v. 53, n. 2, p. 237-243, 1986.
6 EFICÁCIA DO ISOLADO Duddingtonia flagrans SOBRE LARVAS DE