CINÉTICA DO CRESCIMENTO MICROBIANO DAS BRS

Nesta etapa foi determinada a cinética de crescimento da Desulfovibrio

desulfuricans (cepa ambiental e cepa oral) e da Desulfovibrio fairfieldensis em meio

de cultura Postgate E modificado sem Agar-agar e meio de cultura Postgate C sem Agar-agar, em condição aeróbica e anaeróbica, a partir da seguinte metodologia descrita em sequência.

Previamente foi preparado um litro de meio de cultura Postgate E modificado sem Agar-agar e de meio de cultura Postgate C sem Agar-agar. Para cada cepa utilizada (Desulfovibrio desulfuricans ambiental e oral e Desulfovibrio

fairfieldensis) e para cada condição a ser utilizada na curva de crescimento

(anaeróbica e aeróbica) foi realizada, dentro da câmara de Fluxo Laminar, a transferência de uma alíquota de 1,0 mL do meio de cultura original (meio Postgate E modificado com a bactéria cultivada) para um meio de cultura Postgate E modificado sem Agar-agar e meio Postgate C sem Agar-agar. Estes cultivos foram incubados por sete dias a 30° C em estufa. Após o preparo das amostras foi determinada a cinética de crescimento das cepas de BRS em condição aeróbica e anaeróbica:

Cinética de crescimento em anaerobiose foi realizada em duas etapas. Após o período de incubação, cada frasco tipo penicilina de 50 mL contendo o cultivo foi aberto, dentro da câmara de Fluxo Laminar, e vertido em um tubo tipo Falcon de 15 mL. Em seguida, as amostras, foram centrifugadas (centrifuga; Thermo Electron Corporation) a 10.000 g/05 min. para a recuperação das células bacterianas,

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descartando o sobrenadante. Posteriormente, o precipitado de cada amostra foi ressuspendido com solução redutora para bactérias anaeróbias. Seguidamente, foi preparada a câmara de controle atmosférico (anaeróbico), Glove Box (Plas-Labs, INC., #855-AC), conforme recomendado pelo fabricante: repetindo nove vezes o procedimento de ligar o vácuo até uma pressão de 18-20 PSI para posteriormente injetar uma mistura de gás anaeróbico (nitrogênio a 85%, hidrogênio a 10% e dióxido de carbono a 5%) até uma pressão de 25-50 PSI. Após o preparo prévio da Glove Box, a câmara de transferência foi aberta para a colocação do material para este ensaio. Em seguida com a câmara de transferência lacrada, foi realizado por quatro vezes o procedimento de ligar o vácuo até uma pressão de 18-20 PSI para posteriormente injetar a mistura de gás anaeróbico (nitrogênio a 85%, hidrogênio a 10% e dióxido de carbono a 5%) até o manômetro chegar a zero.

Com a Placa de cultivo de 24 poços (BIOFIL®) no interior da Glove Box, foi distribuído 1,5 mL de Meio Postgate E modificado sem Agar-agar em cada um dos 12 poços e 1,5 mL de Meio Postgate C sem Agar-agar em cada um dos demais 12 poços. Posteriormente com o auxílio de uma pipeta as respectivas células, ressuspensas com solução redutora para bactérias anaeróbias, foram distribuídas, sendo inoculados 0,15 µg/l (inoculo de 10%) em cada poço, conforme a tabela 2, sendo em seguida lacrada a placa de cultivo com Parafilm M® (Laboratory Film), para então ser removida da Glove Box (FIG. 3). Em seguida a placa de cultivo foi incubada a 30ºC por 147 horas na leitora de microplacas, BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader (BioteK Instruments, Inc). A cada uma hora a placa era agitada por três segundos e a leitura da absorbância no comprimento de onda de 590 nm era realizada com o auxilio do software Gen5TM (BioteK Instruments, Inc) (FIG. 3).

Tabela 2- Distribuição dos meios de cultivo e das células nas placas de cultivo

Meios de

cultivo

Meio de cultura Postgate E modificado

sem Agar-agar Meio de cultura Postgate C sem Agar-agar

Células inoculadas

Meio Branco – sem inoculação de bactérias (3 poços)

Meio Branco – sem inoculação de bactérias (3 poços)

Inoculação de Desulfovibrio desulfuricans (cepa ambiental, 3 poços)

Inoculação de Desulfovibrio desulfuricans (cepa ambiental, 3 poços) Inoculação de Desulfovibrio desulfuricans

(cepa oral, 3 poços)

Inoculação de Desulfovibrio desulfuricans (cepa oral, 3 poços)

Inoculação de Desulfovibrio fairfieldensis (cepa oral, 3 poços)

Inoculação de Desulfovibrio fairfieldensis (cepa oral, 3 poços)

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Figura 3- Inoculação da placa de cultivo na Glove Box

Fonte: Heggendorn, FL. A – Glove Box; B - leitora por Polarização de fluorescência; C e D – Inoculação das cepas bacterianas na placa de cultivo.

A cinética de crescimento em aerobiose ocorreu segundo protocolo em sequencia. Após o período de incubação, cada frasco tipo penicilina de 50 mL contendo o cultivo foi aberto dentro da câmara de Fluxo Laminar, e vertido em um tubo tipo Falcon de 15 mL. Posteriormente, os frascos tipo penicilina de 50 mL contendo o restante dos cultivos não utilizados na lavagem celular foram vertidos em recipientes plásticos de 10 mL, onde foi realizada a medição do pH destes cultivos através de tiras indicadoras de pH, que permaneceram imersas nos cultivos por 10 minutos, as quais, posteriormente, foram comparadas a tabela indicadora de pH. As amostras no tubo tipo Falcon foram centrifugadas a 10.000 g/ 5 min para a recuperação das células bacterianas, o sobrenadante resultante de cada cepa foi vertido em tubo tipo Falcon de 15 mL e congelado a -80°C (Ultra-low temperature freezer; INNOVA® U535) para os posteriores testes de citotoxicidade com extrato celular no Grupo 3 dos testes de citotoxicidade por contato direto. Seguidamente, o precipitado de cada amostra foi ressuspendido com solução redutora para bactérias anaeróbias, centrifugado a 10.000 g/5 min.

Com a Placa de cultivo de 24 poços dentro da câmara de Fluxo Laminar, foi distribuído 1,5 mL de Meio Postgate E modificado sem Agar-agar em cada um dos 12 poços e 1,5 mL de Meio Postgate C sem Agar-agar em cada um dos demais 12 poços (FIG. 4). Posteriormente com o auxílio de uma pipeta as respectivas células

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ressuspensas foram distribuídas, sendo inoculados 0,15 µg/l (inoculo de 10%) em cada poço, seguindo o mesmo padrão de distribuição relatado no ensaio de anaerobiose, conforme a tabela 2. Em seguida a placa de cultivo foi incubada a 30ºC por 147 horas na leitora de microplacas. A cada uma hora a placa era agitada por três segundos e a leitura da absorbância no comprimento de onda de 590 nm era realizada com o auxilio do software Gen5TM.

Figura 4- Placa de cultivo em condições de aerobiose

Fonte: Heggendorn, FL.