3. Resultados e discussão
2.5. Citometria de fluxo
As análises de citometria de fluxo foram conduzidas com base na metodologia proposta por Chan et al.(23). As especificações dos corantes e a metodologia detalhada do preparo do tampão e das soluções fluorescentes estão descritas nos Materiais Suplementares -
Apêndice.
Figura 1- Metodologia esquematizada das fermentações com o reciclo de células, lavagem ácida e os pontos coletados para a
2.5.1. Preparo das amostras
Para o preparo das amostras para a citometria de fluxo, todas as centrifugações foram realizadas nas condições de 3200 × g por10min a 5 ° C em tubos eppendorf em centrífuga Eppendorf® Minispin® e MiniSpin Plus microcentrífuga pessoal (Eppendorf, Hamburg, Germany). Alíquotas de 1 mL do vinho com levedura centrifugadas e suspendidas em PBS (tampão fosfato salino) foram distribuídas em 6 eppendofs, e novamente centrifugado. Em seguida, as células de dois eppendorfs foram fixadas em etanol 95% durante 15 minutos (para os testes com os corantes Acriflavina e A-FITC). Após a fixação, estas amostras foram centrifugadas e juntamente com demais amostras seguiram para a etapa de coloração.
Como mostrado no fluxograma da Figura 2, os corantes FDA e Acriflavina foram aplicados primeiro, devido ao elevado tempo de interação entre o corante com a amostra. A solução de FDA - (Fluoresceína Diacetato) foi utilizada para a detecção da vitalidade celular. A coloração foi realizada por meio da homogeneização de 50 µl da solução de FDA em 50 µl da suspensão de células, em seguida, incubado por 1 hora a 37°C. A solução de Acriflavina foi utilizada para corar glicogênio intracelular. As amostras foram coradas com a homogeneização de 2 µL da solução de Acriflavina em 1 mL de suspensão de células. As amostras coradas com Acriflavina ficaram incubadas por 1 hora no escuro sob a 25 ° C. Após o período de incubação, as amostras coradas com FDA e Acriflavina foram centrifugadas e lavadas com PBS duas vezes seguidas antes da análise no citômetro de fluxo.
A concentração de trealose intracelular foi evidenciada com a solução de A-FITC (Isotiocianato de fluoresceína - A). As amostras foram preparadas adicionando-se 20 µl da solução A-FITC em 1mL de da suspensão de células, incubado por 20 minutos no escuto a 25 ° C. Após o tempo de incubação, as amostras coradas com A-FITC foram centrifugadas e lavadas com PBS por duas vezes seguidas. A análise de trealose foi realizada somente em T1 e T3.
A viabilidade celular foi analisada com base na integridade do material genético pelo corante AO (Alaranjado de Acridina) e pela integridade da membrana plasmática pela interação com o corante PI (Iodeto de propídio). Para a coloração com AO a amostra foi preparada com 200 µl de solução de AO em 200 µl de suspensão de células célula. E para análise de PI foi adicionado 5 µl de PI (1 mg.mL-1) em 1ml de suspensão de célula. Estes ensaios foram analisados separadamente em citômetro de fluxo imediatamente após a mistura
do corante com a suspensão de células. A viabilidade foi estabelecida pelas médias geométricas da intensidade de fluorescência de AO e PI. O branco da amostra foi preparado com a centrifugação e suspensão das células em PBS sem a adição de corantes.
2.5.2. Obtenção e análise dos dados de citometria de fluxo
Cada uma das quarto replicatas de cada fermentação foi analisada no Gallios® Flow Cytometer (Beckman Coulter, Inc., Brea, EUA) para a aquisição dos dados de fluorescência relativos a viabilidade, vitalidade, glicogênio e trealose celular. Foram considerados 104 eventos analisados por corrida. As amostras coradas com AO, Acriflavina, e A-FITC foram excitadas com comprimento de onda em 488 nm e a fluorescência emitida na região de 525/20 nm foi detectada utilizando do canal FL 1. As amostras coradas com PI também foram excitadas em comprimento de onda em 488nm, porém a fluorescência emitida foi detectada na região de 620/30 nm utilizando do canal FL 3. O tratamento dos dados foi realizado no software KALUZA® e FlowJo™, sendo os resultados expressos pelo média geométrica da intensidade da fluorescência – (Geometric Mean of Fluorescence Intensity - GMFI) como mostrado pela Figura 3.
Figura 2- Fluxograma da metodologia sequencial de coloração das células de levedura para citometria de fluxo com os corantes
2.6. Análise estatística
Todas as fermentações foram realizadas em quadruplicata para cada variável (LMQA SRC 143, LMQA SRC 143 BAL, PE-2, PE-2 BAL). Os dados de variação do pH e da concentração do substrato das fermentações foram apresentados pela média dos quatro valores com o desvio padrão correspondente. Os dados de concentração de etanol foram apresentados pela média dos resultados das três análises cromatográficas realizadas com a amostra mista (4 mL de amostra composta por 1 mL de cada fermentação como descrito no item 1.2.4) e o desvio padrão correspondente. A correlação entre os dados da concentração de etanol, consumo de substrato e pH foi realizada pela análise de correlação simples entre variáveis sendo considerado 1 % de significância (p < 0.01). As análises por citometria de fluxo foram realizadas independentemente para cada fermentação, ou seja, cada uma das quatro replicatas de cada fermentação foram coradas e analisadas individualmente. Os resultados para cada variável em função de cada corante AO, PI, FDA, ACRIFLAVINA ou A-FITC foram expressos pela média das 4 leituras com o desvio padrão correlato.
Tanto os dados fermentativos (pH, concentração de soluto e etanol) quanto os dados da fisiologia celular (média geométrica da intensidade da fluorescência emitida) tiveram a variância investigada pela ANOVA. Os dados foram comparados entre os diferentes tipos de inóculo (P, PB, L e LB) para avaliação do efeito da contaminação bacteriana, e entre as oito fermentações para avaliação do efeito do reciclo celular e lavagem ácida. A diferença
Figura 3- Esquematização da análise dos dados através do software FlowJo® para a obtenção da média geométrica da
estatística significativa com 5 % de significância (p ≤ 0.05) entre os dados com distribuição normal foi determinada pelo teste paramétrico de Scott-Knott, enquanto que a comparação estatística entre os dados não-normais foi determinada utilizando o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Além disso, somente a comparação entre os valores iniciais e finais da concentração de trealose (dados de A-FITC) foram comparados pelo teste não-paramétrico de Mann-Whitney ao nível de 5 % de probabilidade. Todo os testes estatísticos deste trabalho foram realizados com o software Assistat versão 7.7 pt – free software - 2017 (Campina Grande, Brazil) (30).