Citotoxicidade in vitro pelo ensaio de MTT

O efeito da citotoxicidade in vitro das quitosanas, das bases de Schiff biopoliméricas e dos complexos foi avaliado contra as células de carcinoma de mama MCF-7 durante 24 horas utilizando o ensaio de MTT. O Triton-X (4% em solução tamponante de fosfato) foi empregado como controle negativo e a percentagem da viabilidade celular relativa foi calculada utilizando as células não tratadas como controle positivo.

_____________________________________________________Resultados e Discussão 128

Os resultados demostraram que todos os compostos testados presentaram uma diminuição na percentagem de viabilidade celular relativa em função da concentração. Os compostos sintetizados foram testados nas concentrações de 5, 30 e100 µg mL-1_.

As bases de Schiff biopoliméricas QS, QMeO e QNO2 apresentaram valores de

viabilidade variando inicialmente de 80% nas concentrações mais baixas de amostra e chegando a 30% de viabilidade para as concentrações mais altas. Sendo a base de Schiff biopolimérica QNO2 a mais citotóxica nas concentrações mais elevadas. Já para a quitosana QP, a

percentagem observada foi em torno de 75% em todas as concentrações testadas (Figura 37 a).

Portanto, para as bases de Schiff biopoliméricas da primeira serie de compostos foi observada a seguinte ordem citotoxicidade:

QNO2 > QMeO > QS > QP

Os resultados dos ensaios de MTT para os complexos de Pd(II) e Pt(II) preparados com as bases de Schiff biopoliméricas revelaram diminuição na percentagem de viabilidade das células MCF-7 após 24 horas especialmente nas concentrações mais elevadas em comparação aos resultados obtidos para as bases de Schiff biopoliméricas sem metal (Figura 37 b). Indicando que os complexos foram mais citotóxicos para as células tumorais testados que os ligantes, as bases de Schiff biopoliméricas sem metal. Os complexos de paládia QS-Pd e QMeO-Pd apresentam maior redução da viabilidade celular que os complexos de platina QS-Pt e QMeO-Pt, especialmente na concentração de 100 µg mL-1_{. Já entre os complexos}

QNO2-Pd e QNO2-Pt não foi observada significativa diferenças em relação a citotoxicidade dos

diferentes metais. De formal geral, todos os complexos apresentaram elevado potencial citotóxico reduzindo significativamente a viabilidade celular das células tumorais MCF-7, após 24 horas de incubação até na menor concentração avaliada 5 µg mL-1_.

_____________________________________________________Resultados e Discussão 129

Figura 37 - Viabilidade celular das células MCF-7 por 24 horas em relação às quitosanas, bases de

Schiff biopoliméricas e dos complexos nas concentrações de 5, 30 e 100 µg mL-1 _{em λ = 570 nm. Sendo}

a) as bases de Schiff biopoliméricas QS, QMeO, QNO2; b) complexos de paládio e platina das

respectivas bases de Schiff biopoliméricas. Valores médios ± desvio (n = 3).

QP QS QMeO QNO2 Contro le (-) Con trole (+) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 V ia b ili d a d e r e la ti v a / % 5 µg/mL 30 µg/mL 100 µg/mL Controle (-) Controle (+) a) QS-P d Qs-P t QMeO -Pd QMeO -Pt QNO2 -Pd QNO2 -Pt Con trol (- ) Con trol (+ ) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 V ia b ili d a d e R e la ti v a / % 5 µg/mL 30 µg/mL 100 µg/mL Control (-) Control (+) b)

O efeito da citotoxicidade in vitro das quitosanas, das bases de Schiff biopoliméricas anfifílicas de diferentes massas molares e dos seus complexos de zinco, paládio e platina foi avaliado contra as células de carcinoma de mama MCF-7 e contra as células não tumorais de fibroblastos (Balb-C 3T3 clone A31) durante 24 horas utilizando o ensaio de MTT. O Triton- X (4% em solução tamponante de fosfato) foi empregado como controle negativo para as células tumorais e a percentagem da viabilidade celular relativa foi calculada utilizando as células não tratadas como controle positivo.

Para os compostos de média massa molar (223 kDa) a quitosana QP, a bases de Schiff biopoliméricas anfifílicas QPSG e seus complexos de zinco, paládio e platina os resultados de viabilidade celular contra as células tumorais MCF-7 estão apresentados na Figura 38 a) e contra as células não tumorais de fibroblastos (Balb-C 3T3 clone A31) estão apesentados na Figura 38 b).

Os resultados indicaram claramente que com o aumento da concentração ocorreu uma redução da viabilidade celular para todas as amostras testadas. A quitosana sem modificação QP apresentou menor efeito citotóxico que a base de Schiff biopolimérica anfifílica tanto contra as células MCF-7 e quanto contra as células Balb-C 3T3 clone A31.

_____________________________________________________Resultados e Discussão 130

Figura 38 - Viabilidade celular em relação a quitosana de média massa molar (223 kDa) QP, base de Schiff biopolimérica (QPSG) e dos complexos de zinco, paládio e platina dessas bases de Schiff

biopolimericas anfifílicas por 24 horas nas concentrações de 5, 30 e 100 µg mL-1 _{em λ = 570 nm. Sendo}

a) Viabilidade celular das células tumorais MCF-7 e b) Viabilidade celular das células não tumorais Balb-C 3T3 clone A31. Valores médios ± desvio (n = 3).

QP QPSG QPSG -Zn QPSG -Pd QPSG -Pt Con trole (-) Con trole (+) 0 20 40 60 80 100 120 V ia b ili d a d e R e la ti v a / % 5 µg/mL 30 µg/mL 100 µg/mL Controle (-) Controle (+) a) QP QPSG QPSG -Zn QPSG -Pd QPSG -Pt Con trole( - ) 0 20 40 60 80 100 120 5 µg/mL 30 µg/mL 100 µg/mL Controle (-) V ia b ili d a d e R e la ti v a / % b)

As bases de Schiff biopolimericas anfifílicas e os seus complexos apresentaram menores valores de viabilidade celular para as células MCF-7que para as células saudáveis de fibroblastos. Em relação aos resultados obtidos para as células tumorais apresentados na Figura 38 a) foi observado que base de Schiff QPSG apresentou-se mais extremamente potente contra as células tumorais reduzindo a viabilidade para aproximadamente 40% em todas as concentrações analisadas. O complexo de zinco QPSG-Zn não apresentou significativa toxicidade em baixa concentração 5 µg mL-1 _{a percentagem da viabilidade foi em torno de 80%,}

porém esse foi o composto mais citotóxico na concentração mais elevada 100 µg mL-1_,

viabilidade em torno de 20%, comparado os complexos de paládio QPSG-Pd e platina QPSG-Pt com viabilidade de aproximadamente 55 e 40%, respectivamente.

Os resultados de viabilidade celular com as celulas de fibroblastos demonstrou que embora a base de Schiff biopolimeica anfifílica QPSG foi extremamente potente para as células tumorais nas concentrações investigas, essa base de Schiff, também reduziu a viabilidade celular das células de fibroblastos saudáveis especialmente na concentração mais elevada. Já o complexo de zinco QPSG-Zn que se apresentou menos potente em relação as células tumorais foi mais seletivos que a base de Schiff biopolimeirca anfifílica, pois não reduziu a viabilidade celular das células saudáveis em nenhum das concentrações testadas. Além disso, o complexo de zinco QPSG também apresentou-se mais seletivo em relação aos outros complexos

_____________________________________________________Resultados e Discussão 131

QPSG-Pd e QPSG-Pt, pois na concentração de 100 µg mL-1 _{os complexos de paládio e platina}

reduziram drasticamente a viabilidade celular das células de fibroblastos(Figura 38 b ).

Portanto, dessa forma pode-se verificar que após a complexação especialmente com zinco, o composto apresenta potencial citotóxico e principalmente significativa seletividade para células não tumorais.

Em relação os compostos de baixa massa molar (64 kDa) a quitosana QD, a bases de Schiff biopoliméricas anfifílicas QDGS seus complexos de zinco, paládio e platina os resultados de viabilidade celular contra as células tumorais MCF-7 estão apresentados na Figura 39 a) e contra as células não tumorais de fibroblastos (Balb-C 3T3 clone A31) estão apesentados na Figura 39 b).

Os resultados também indicaram claramente que com o aumento da concentração há uma redução da viabilidade celular para os ligantes e para os complexos. Assim como para os compostos de média massa molar para os de baixa massa molar a quitosana sem modificação QD, apresentou menor efeito citotóxico que a base de Schiff biopolimérica anfifílica QDGS tanto contra as células MCF-7 e quanto contra as células Balb-C 3T3 clone A31.

Além disso, a base de Schiff biopolimericas anfifílica QDGS apresentou-se muito potente contra as células tumorais, porém pouco seletiva em relação as células saudáveis. Uma vez, que reduzem a viabilidade das células saudáveis na concentração 100 µg mL-1

(Figura 39 a ))

Já em relação aos complexos de baixa massa molar todos foram potentes em relação a células tumorais principalmente o complexo QDGS-Zn na concentração 100 µg mL-1_{, pois a}

percentagem de viabilidade observada foi menor que 20%. Os complexos de paládio e platina QDGS-Pd e QDGS-Pt apresentaram significativa toxicidade para as células tumorais, porém são seletivos em relação as células saudáveis de fibroblastos apenas em baixas concentrações, na concentração elevada de100 µg mL-1 _{foi observada significativo efeito citotóxico para tais}

_____________________________________________________Resultados e Discussão 132

Figura 39 - Viabilidade celular em relação a quitosana de baixa massa molar (64 kDa) QD, base de Schiff biopolimérica (QDGS) e dos complexos de zinco, paládio e platina dessas bases de Schiff

biopolimericas anfifílicas por 24 horas nas concentrações de 5, 30 e 100 µg mL-1 _{em λ = 570 nm. Sendo}

a) Viabilidade celular das células tumorais MCF-7 e b) Viabilidade celular das células não tumorais

Balb/C 3T3 clone A31.Valores médios ± desvio (n = 3).

QD QDGS QDGS -Zn QDGS -Pd QDGS -Pt Con trole (-) Con trole (+) 0 20 40 60 80 100 120 V ia b ili d a d e R e la ti v a / % 5 µg/mL 30 µg/mL 100 µg/mL Controle (-) Controle (+) a) QD QDGS QDGS -Zn QDGS -Pd QDGS -Pt Con trole (- ) 0 20 40 60 80 100 120 b) V ia b ilid a d e R e la tiv a / % 5 µg/mL 30 µg/mL 100 µg/mL Controle (-)

As modificação da estrutura da quitosana com o salicilaldeído e com o glicidol conferem maior citotoxicidade ao biopolimero. Tanto QP e QD apresentaram valores de viabilidade celular em torno de 60% nas concentrações testadas de 5 a 100 µg mL-1_{, enquanto que para as}

amostras QPSG e QDGS a percentagem média de viabilidade celular foi em torno de 40% nas mesmas concentrações.

Portanto, a toxicidade da base de Schiff biopolimérica anfifílica QPSG foi maior que da base de Schiff biopolimérica anfifílica QDGS. Essa maior atividade antitumoral pode ser atribuída ao efeito do grupo hidrofóbico salicilaldeído. Uma vez que, o valor de ( ) de salicilaldeído é maior que para QPSG do que para a base de Schiff biopolimérica anfifílica QDGS (Tabela 5). Além disso, o valor do ( ) do grupo hidrofílico glicidol é menor para QPSG que QDGS, o que pode influenciar ainda no efeito citotóxico. Provavelmente ocorrem interações eletrostáticas entre bases de Schiff biopoliméricas anfifílicas com as bases nitrogenadas do DNA, e assim contribuindo com o aumento da toxicidade. Desta forma, os resultados demonstraram que o aumento da toxicidade está mais relacionado a substituição de grupo na cadeia da quitosana, do que na variação da massa molar.

Esses resultados estão de acordo com observações anteriores de Abdelwahab e colaboradores (ABDELWAHAB et al., 2015) que demostraram a eficácia das outras bases de

_____________________________________________________Resultados e Discussão 133

Schiff biopoliméricas sintetizadas a partir de quitosanas contra células do câncer de mama (MCF-7), células de câncer de colón (HCT-116) e câncer hepatocelular (HepG-2). Esses efeitos podem ser atribuídos a interações entre as bases de Schiff biopoliméricas com as bases nitrogenadas do DNA.

Em relação aos complexos os valores de viabilidade variaram de 76 a 10% para QDGS- Zn e de 85 a 23% para QPSG-Zn, ou seja, os complexos de menor massa moalr forma mais potentes em relação aos de média massa molar, provavelmente devido à capacidade desses compostos em interagir com os grupos fosfato do DNA. Os complexos de paládio QPSG-Pd e QDGS-Pd demonstraram quase o mesmo comportamento e os valores de viabilidade celular variaram de 60 a 47%. No entanto, para os complexos de platina foi verificado um efeito em função da variação dos valores de ( ) , assim como os complexos e zinco os complexos de platina de baixa massa molar foram mais citotóxicos que os de média massa molar. Para QPSG-Pd os valores de viabilidade celular variaram de 57 a 38% e para QDGS-Pd foram obtidos os valores de 38 a 32%.

De acordo com Cardoso e Micaelo (CARDOSO; MICAELO, 2011) as ligações de hidrogênio também podem ocorrer entre alguns complexos e as bases nitrogenadas do DNA celular. Esse tipo de interação sempre pode variar de acordo com o tipo de células as quais os compostos foram testados.

De forma geral, foi observado que a complexação promoveu o aumento do potencial citotóxico comparado com os ligantes as bases de Schiff biopolimpericas anfifílicas, tanto para os compostos de média massa molar quanto para os de baixa massa molar. Uma possível explicação relacionada à diminuição da viabilidade celular causada pelos complexos pode ser atribuída à geometria quadrado planar dos complexos Pd(II) e Pt(II) o que possibilita interação com a estrutura secundária do DNA, potencialmente inibindo sua a replicação (KAVITHA; LAXMA REDDY, 2016). Além disso, a atividade antitumoral desses complexos provavelmente envolve a inibição da ribonucleótido redutase, que converte ribonucleótidos em desoxirribonucleótidos, levando às mudanças no material genético (QUIROGA et al., 1998).

Inúmeros complexos de platina, paládio e também de outros metais vem sendo sintetizados visando atingir as células tumorais com a mesma eficiência que o quimioterápico cisplatina. Porém, o desfio ainda é obter um composto com significativa eficiência e reduzida toxicidade às células não tumorais (JAIVIDHYA et al., 2012). Nesse sentido, os resultados

_____________________________________________________Resultados e Discussão 134

obtidos para os complexos de zinco tanto QPSG-Zn quanto QDGS- Zn demonstraram que tais complexos foram bem seletivos em relação as células testadas, pois mesmo em elevada concentração 100 µg mL-1 _{foi verificada uma siginificativa seletividade em relação as células}

saudáveis, ou seja, os compostos reduziam a viabilidade das células tumorais, porém não reduziram a viabilidade das células saudáveis.

Portanto, nesse estudo preliminar foi observado que as bases de Schiff biopoliméricas de quitosana e os complexos de zinco, paládio e platina, sintetizados a partir dessas bases, apresentaram um potencial para aplicações antitumorais. Uma vez que, todos os compostos sintetizados, apresentaram valores de viabilidade celular significativos em todas as concentrações testadas, indicando alta toxicidade para as células tumorais testadas. Além disso, os complexos sintentizados apresentaram-se seletivos, portanto são compostos com potencial para aplicações farmacológicas.

_______________________________________________________________Conclusão 136

5 CONCLUSÃO

Na primeira etapa desse trabalho foram sintetizadas e caracterizadas bases de Schiff biopoliméricas de quitosana com salicilaldeído e alguns de seus derivados substituídos no carbono 5 do anel aromático (5-metóxi e 5-nitrosalicilaldeído). A partir desses ligantes foram sintetizados os complexos de zinco(II), paládio(II) e platina(II). Os compostos sintetizados foram caracterizados por diferentes técnicas espectroscópicas, analíticas e térmicas. Os resultados demonstraram que as sínteses e a complexação foram realizadas de forma satisfatória. O comportamento térmico, tanto de QP quando das bases de Schiff biopoliméricas foram relativamente semelhante, em relação às etapas de decomposição que foram observadas, porém a quitosana substituída com salicilaldeído e derivados demostrou maior estabilidade térmica que o biopolímero sem modificação. As percentagens de resíduo obtidas após a decomposição térmica foram utilizadas para se avaliar a quantidade de metal complexado pelas bases de Schiff. Para os complexos da primeira série de sínteses foi verificada uma maior percentagem de resíduo após a queima para os complexos de platina, seguido de paládio e zinco. As interações metal-base de Schiff biopoliméricas foram evidenciadas também pelos resultados de FTIR, observando-se novas bandas relacionadas às ligações metal-nitrogênio e metal- oxigênio. Medidas de UV-Vis, com as amostras no estado sólido apresentaram bandas relacionadas às transições d-d dos complexos de paládio e platina. Além disso, os resultados de DRX também foram utilizados para caracterizar, tanto os resíduos obtidos após a análise térmica dos complexos, quanto para se avaliar a distribuição dos grupos funcionais nos biopolimeros sintetizados. Já as micrografias de MEV, juntamente com as análises de EDS indicaram claramente a presença dos metais na estrutura biopolimérica.

Na segunda etapa do trabalho foi sintetizada uma nova série de bases de Schiff biopoliméricas preparadas com quitosanas com diferentes massas molares (QP e QD), salicildeído (grupo hidrofóbico) e glicidol (grupo hidrofílico) produzindo as bases de Schiff biopoliméricas anfifílicas. A partir dessas bases de Schiff biopoliméricas anfifílicas, também foram sintetizados os complexos de zinco(II), paládio(II) e platina(II). Essa segunda série de compostos foi preparada a fim de se avaliar o efeito da presença do grupo hidrofílico glicidol na solubilidade e também o efeito da variação da massa molar nas possíveis aplicações biológicas desses compostos.

Esses novos compostos também foram caracterizados por diferentes técnicas e suas estruturas foram confirmadas por espectroscopia de 1_{H-RMN e FTIR. Foi observado aumento}

_______________________________________________________________Conclusão 137

termogravimetria revelou que as bases de Schiff biopoliméricas anfifílicas também apresentaram menor estabilidade térmica do que as quitosanas sem modificação.

A percentagem de resíduo inorgânico obtida após a análise termogravimétrica demonstrou que para as bases de Schiff biopoliméricas anfifílicas QPSG e QDGS a complexação dos metais ocorreu de forma mais eficiente, pois as percentagens de resíduos variaram de 10 a 40% para QPSG e QDGS, já para as bases QS, QMeO e QNO2 foram

observados valores entre 5 e 20%. Além disso, para os complexos de paládio e platina a redução da massa molar média das cadeias biopoliméricas aumentou a capacidade de complexação, pois rendimentos de complexação foram maiores para os complexos QDGS do que para QPSG. Todas as demais técnicas utilizadas para caracterizar os compostos sintetizados na primeira etapa foram empregadas para caracterizar os compostos produzidos nessa segunda etapa do trabalho.

Estudos preliminares sobre a atividade microbiológica e a avaliação da citotoxicidade das quitosanas, de todas as bases de Schiff biopoliméricas e dos complexos obtidos foram realizados contra dois agentes patogênicos: a bactéria Pseudomonas syringae pv. tomato e o fungo de cereais Fusarium graminearum. Além disso, foram utilizadas células de carcinoma de mama MCF-7 na avaliação da viabilidade celular. As bases de Schiff biopoliméricas demonstraram uma atividade antibacteriana muito melhor do que a quitosana sem modificação, as bases de Schiff biopoliméricas foram mais eficientes contra as bactérias Gram-negativas testadas, do que contra o fungo. As bases de Schiff biopoliméricas anfifílicas exibiram eficiência antibacteriana contra Pseudomonas syringae. Já as quitosanas sem modificação QP e QD exibiram melhor atividade antifúngica contra o fungo Fusarium graminearum. Os valores obtidos de IC50 inferiores a 24 μg mL-1, enquanto que para as quitosanas modificadas foram

observados valores maiores de IC50 nesses ensaios.

Os complexos sintetizados assim como as bases de Schiff biopoliméricas demonstraram atividade antibacteriana eficiente contra a bactéria Gram-negativa testada, porém para o fungo Fusarium graminearum a atividade foi limitada e, para alguns complexos, ineficiente. Isso envidencia que diferentes mecanismos de interação entre os compostos sintetizados e os microrganismos testados. Sendo assim, pode-se concluir que a morfologia dos microrganismos testados está diretamente relacionada com o principal mecanismo de ação o qual é responsável por uma efetiva atividade antimicrobiana.

_______________________________________________________________Conclusão 138

Em relação à avaliação da citotoxicidade, as bases de Schiff biopoliméricas apresentaram maior efeito citotóxico contra as células de carcinoma de mama MCF-7 do que a quitosana. Para QPSG e QDGS a percentagem de viabilidade celular obtida foi em torno de 35%, mesmo em concentrações menores. Os ensaios antitumorais mostraram que todos os complexos, incluindo os de zinco, apresentaram eficiência antitumoral significativa em concentrações mais elevadas (100 μg mL-1_{). Interessante ressaltar que em baixas concentrações}

(5 μg mL-1_{) os complexos de zinco apresentaram baixa toxicidade, pois a percentagem da}

viabilidade relativa obtida foi em torno de 80%. Os complexos de paládio e platina apresentam o mesmo perfil de atividade, ou seja, com o aumento da concentração foi observado um aumento na toxicidade. Porém, mesmo em menor concentração, os complexos apresentaram significativa redução da viabilidade celular. Os complexos de platina foram ligeiramente mais citotóxicos que os de paládio para as células MCF-7 testadas. Portanto, pode-se concluir que quitosanas substituídas apresentam potencial para agirem como ligantes, na complexação de metais de transição, uma vez que, tanto os ligantes, quanto os complexos, foram caracterizados por diferentes técnicas e todas demostram de alguma forma que a substituição ocorreu de forma satisfatória.

A funcionalização da quitosana com salicilaldeído e glicidol melhorou a solubilidade das bases Schiff biopoliméricas e contribuiu de forma a potencializar a complexação dos metais. Além disso, de forma geral as bases de Schiff biopoliméricas e os respectivos complexos apresentaram atividade microbiológica mais significativa contra a bactéria Pseudomonas syringae do que contra do fungo Fusarium graminearum, devido às diferenças morfológicas entre os microrganismos. Assim, é importante manter um balanço entre o caráter hidrofílico e hidrofóbico dos polímeros, dependendo do microrganismo alvo. Sendo assim, esses resultados permitem concluir que, tanto as bases de Schiff biopoliméricas, quanto os complexos preparados apresentam potencial interessante para atuarem em diferentes aplicações biológicas.