Para caracterizar tanto funcional quanto estruturalmente as proteínas MpNEPs (MpNEP1 e MpNEP2) , os genes codificadores para estas proteína foram clonados, expressos e as proteínas purificadas para posteriores ensaios de inoculação em plantas. O gene npp1 (AF352031) de Phytophthora parasítica foi utilizado como controle já que codifica para uma proteína NPP1 (AAK19753) cuja função de indução de necrose fora comprovada (Fellbrish, 2002). Os três genes foram clonados em sistema de expressão de E. coli usando a série dos vetores pET.
Desenho de oligonucleotídeos
Os oligonucleotídeos para amplificação dos genes MpNEPs de M. perniciosa foram desenhados baseado na seqüência dos genes sem incluir a região do peptídeo sinal e com temperaturas de melting (Tm) superiores a 55°C. O Prof. Julio Cascardo (UESC, Ilhéus, Bahia) desenhou oligonucleotídeos para a amplificação de um fragmento do gene de actina de M. perniciosa, e oligonucleotídeos para a amplificação de um fragmento do gene ribossomal de cacau 18S. O programa Primer3 (primer3_www.cgi v 0.2) foi utilizado para análise de autocomplementaridade dos oligonucleotídeos. A Tabela 1 mostra uma lista dos oligonucleotídeos utilizados durante o desenvolvimento do trabalho.
Determinação da concentração de ácidos nucléicos:
A concentração de DNA ou RNA foi determinada por espectroscopia de absorção-UV. Foi medida a densidade ótica (OD) a 260 nm. As concentrações foram calculadas usando coeficiente de extinção molar ε= 0,03 cm-1 mg-1 mL para
Tabela 1. Oligonucleotídeos usados para amplificação dos genes de interesse. A região sublinhada corresponde com o sítio de restrição.
Gene Seqüências 5´- 3´ Sítio de
restrição MpNEP1 F: GGAATTCCATATGGCTCCACATCAGCTTCC R: CGGGATCCTTACTACCACATCCAAGCCC BamHINdeI MpNEP2 F: CGTCTCAGGATCCATTGCCGGC R: CCAAGCTTTCACTACTACCACATCCAAGCC BamHI HindIII
NPP1 AF352031 F: GGAATTCCATATGGACGTGATCTCGCACGATGC R: CGGGATCCTTACTAAGCGTAGTAAGCGTTGCC NdeI BamHI Mp-actina EF066485 F: CCACAATGGAGGACGAAGTCG R: CCCGACATAGGAGTCCTTCTG F: CAAGCGATCTTTTCGTAGGC TC-S18 R: CGAAGATAAAATCCGAGCTTGT Estratégia de clonagem
Os genes MpNEP1 e MpNEP2 sem o peptídeo sinal foram amplificados a partir do DNA genômico utilizando oligonucleotídeos específicos (Tabela 1). NPP1, (também sem peptídeo sinal), foi amplificada usando os oligonucleotídeos NPP1-F e NPP1-R (Tabela 1) a partir de DNA genômico de Phytophthora parasítica. As reações de amplificação por PCR foram realizadas segundo o protocolo descrito na seção de Southern blot (obtenção do gene MpNEP1 para preparação da sonda), utilizando o mesmo programa de amplificação.
Para a clonagem, os produtos de PCR foram digeridos com enzimas de restrição cujos sítios de reconhecimento foram inseridos nas seqüências dos oligonucleotídeos. Os vetores de expressão foram digeridos com as enzimas de restrição correspondentes. MpNEP1 foi clonada em NdeI-BamHI (Invitrogen, EUA) no pET15b (Figura 3), MpNEP2 foi clonada no laboratório do Prof. Dr. Julio Cascardo (UESC/Ilhéus, Bahia) utilizando o vetor pET28a (Figura 4) nos sítios BamHI-HindIII (Invitrogen, EUA) e NPP1 foi clonado no pET28a usando os sítios Nde/-BamHI (Invitrogen, EUA). Para a realização das reações de digestão dos plasmídeos e dos genes, assim como para as reações de ligação foram seguidas as recomendações dos fabricantes.
Figura 3. pET 15b (Invitrogen, EUA):
Figura 4. pET 28a (Novagem):
Uma vez realizada a reação de ligação se procedeu à transformação dos produtos da reação e à posterior seleção dos plasmídeos recombinantes. Foram utilizadas várias linhagens de bactérias E. coli:
• DH10b (Invitrogen, EUA); Genótipo: F– endA1 recA1 galU galK deoR nupG rpsL ΔlacX74 Φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ– (Grant, 1990). No presente trabalho esta linhagem foi utilizada para a seleção de plasmídeos recombinantes durante a clonagem.
• BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen, EUA); Genótipo: F– ompT hsdSB(rB –
mB –
) gal dcm (DE3) pLysS (CmR). Linhagem utilizada para expressão de proteínas recombinantes. Esta linhagem é crescida em presença de cloramfenicol para manter o plasmídio pLysS dentro da bactéria já que apresenta marcador de resistência para este antibiótico. O plasmídio pLysS codifica a lisozima do fago T7 que forma um complexo com a T7 polimerase inibindo a transcrição. Esta interação reduz (quase elimina) o vazamento do promotor T7 (expressão em estado de não indução) permitindo um maior controle da expressão do gene recombinante (Moffatt, 1987).
• BL21 (DE3) pT-Trx: Genótipo: F– ompT hsdSB(rB –
mB –
) gal dcm (DE3) pT-Trx (CmR). Linhagem utilizada para expressão de proteínas recombinantes. Esta linhagem é capaz de co-produzir a tioredoxina (Trx) de E. Coli aumentando as possibilidades de solubilidade da proteína recombinante.
As linhagens foram crescidas a 37°C em meio Luria Bertani (LB) (1% Triptona, 0,5% extrato de leveduras, 0,5% NaCl) com o cloranfenicol (no caso das linhagens derivadas de BL21 DE3) e em ausência de antibiótico (no caso da linhagem DH10b); para meio sólido utilizou-se 1,5% agar. Posteriormente se procedeu à preparação de células competentes destas linhagens.
Preparação de células competentes
As células competentes de todas as linhagens utilizadas foram preparadas segundo o protocolo descrito por Miller (1995). A partir de uma colônia nova da linhagem preparou-se um pré-inoculo em 50 ml de meio LB líquido. Incubou-se a 37°C em agitação (250 rmp) durante 12h. A partir desse pré-inoculo se preparou um novo inoculo em 500 mL de meio com uma absorbância inicial de OD600 nm 0,1.
O novo cultivo foi incubado a 37°C em agitação (250 rmp) até atingir OD600 nm 0,6 -
0,8. Atingida a OD, as células foram incubadas em gelo por 20 min e posteriormente foram centrifugadas a 4000 g por 15 min. a 4°C. O sobrenadante é descartado e as células foram resuspendidas em igual volume (500 mL) de glicerol 10% gelado. Procedeu-se a centrifugação (nas condições anteriormente descritas). Posteriormente se realizaram dois passos consecutivos, idênticos ao descrito de resuspensão em 250 mL e 20 mL de glicerol 10% respectivamente. Finalmente as células foram resuspendidas em 2 mL de glicerol 10%, aliquotadas em alíquotas de 40 μL e congeladas em nitrogênio líquido. As células foram estocadas a -70°C.
Transformação de células competentes
A transformação das células competentes com os produtos das reações de ligação foi realizada por eletroporação utilizando cubetas de 0,1 cm (Bio Rad). As células competentes da linhagem DH10b foram descongeladas em gelo e adicionou-se o DNA (5μL da reação de ligação). Após 1 min de incubação a temperatura ambiente, a cubeta com a mistura foi colocada no MicroPulser (BioRad) e submetida a impulso elétrico de voltagem 1,8 kVolts. Imediatamente adicionou-se à cubeta 1 mL de meio de cultura LB. Depois de incubar 1h a 37°C sob leve agitação, colocou-se para crescer em placas contendo LB mais o antibiótico correspondente.
Seleção dos transformantes
A extração de DNA plasmidial das colônias contendo possíveis clones recombinantes foi realizada segundo Sambrook e col. (1989). A seleção dos transformantes foi realizada por análise de restrição usando as mesmas enzimas utilizadas para a clonagem. As reações foram realizadas em volume final de 20 μL
utilizando 0,5 μg de DNA ou 5 μL da mini-preparação plasmidial misturado com 1X tampão correspondente (Invitrogen, EUA), 2U de cada enzima de restrição (Invitrogen, EUA). Depois de 2 h de incubação a 37°C, 2 μL de tampão de aplicação 6X foram adicionados à reação. Os resultados foram visualizados em gel de agarose mediante a liberação de um fragmento do tamanho esperado. Os possíveis clones positivos segundo as análises de restrição foram submetidos à amplificação por PCR usando os oligonucleotídeos específicos para cada gene (Tabela 1).
Sequenciamento de DNA
Para a verificação das seqüências dos três genes clonados (MpNEP1, MpNEP2 e NPP1) se procedeu ao sequenciamento dos genes. Com estes fins foi utilizado o protocolo do kit DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing (Amershan Biosciences) segundo recomendações do fabricante. O DNA (correspondente aos plasmídeos recombinantes (pET15b+MpNEp1; pET28a+MpNEP2; pET28a+NPP1) produto da mini-preparação plasmidial foi purificado usando colunas GFX (Amersham, EUA) segundo recomendações do fabricante. Para a reação de sequenciamento foram utilizados de 50 - 200 ng do plasmídio e misturados com 1 μl de oligonucleotídeo específico para cada gene a uma concentração de 5 pM μL- 1 e 8 μL da mistura de reação (Amersham, EUA) em 20 μL de volume total. Para
cada gene clonado foram realizadas duas reações de sequenciamento usando os oligonucleotídeos F e R de cada gene (Tabele 1). As reações foram colocadas em termociclador com o seguinte programa: desnaturação a 90°C por 20 seg., anelamento a 57°C por 15 seg. e extensão a 60°C por 60 seg. Esse ciclo foi repetido 25 vezes. Os produtos da reação foram purificados mediante precipitação com 95% etanol e 2 μL tampão 1,5 M acetato de sódio (pH > 8,0) /50 mM EDTA (Amersham, EUA) seguido por lavagem com 70% etanol. Depois dos precipitados de DNA estarem secos, foram resuspendidos em tampão de aplicação e aplicados no seqüenciador (ABI Prism 377 sequencer). Os cromatogramas resultantes foram analisados utilizando o programa Chromas.
Transformação em linhagens de expressão de E. coli
Os plasmídios recombinantes foram transformados em linhagens de E. coli derivadas de BL21 (DE3). Os plasmídios pET15-MpNEP1 e pET28-MpNEP2 foram transformados em células BL21 (DE3) pLysS enquanto pET28-NPP1 foi transformada em células de BL21 (DE3) pT-Trx. Foi utilizado o protocolo de eletroporação descrito anteriormente.