3. MATERIAL E METODOS
3.2 CLONAGEM MOLECULAR UTILIZANDO O SISTEMA GATEWAY®
3.2.1 Recombinação com os vetores de destinação pTcPRTAPN
Os genes foram amplificados a partir de 100 ng de DNA genômico de T. cruzi,
utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). A enzima utilizada foi a
Platinum Taq Polimerase High Fidelity (Invitrogen), que garante uma boa fidelidade de
sequência e possui uma taxa de erro menor que a enzima Taq Polimerase convencional,
22
utilizada no trabalho prévio (MARTINS, 2009) quando a clonagem de TcRRM2 foi feita
visando a produção de proteínas recombinantes utilizadas para imunização de animais.
Como para este trabalho a clonagem visa a produção das proteínas de interesse fusionadas a
uma etiqueta para futuros ensaios de atividade e interação, qualquer alteração na seqüência
do gene pode prejudicar a atividade da proteína, portanto a amplificação para clonagem no
vetor de entrada foi refeita com uma enzima de alta fidelidade. Os amplicons foram
purificados com uma solução de 30% PEG 8000/ 30mM MgCl
2e a recombinação entre os
amplicons flanqueados por sítios AttB e o vetor de entrada da plataforma Gateway®
pDONR™221, mediada pela enzima BP clonase, foi feita de acordo com o manual do
fabricante (Invitrogen - Catalogo nos. 12535-019 e 12535-027), e o esquema da
recombinação é demonstrado na Figura 3.1.
FIGURA 3.1 – Esquema da recombinação mediada pela enzima BP Clonase. Modificado de: www.invitrogen.com
A partir do inserto clonado no vetor de entrada, foi realizada a recombinação com o
vetor pTcTAPN, desenvolvido no Instituto Carlos Chagas por BATISTA et al (2010), que foi
construído de modo que dois sitios ATTR flanqueassem uma sequência ccdb, que é
substituída pelo inserto de interesse após recombinação com o vetor de entrada, mediada
pela enzima LR clonase. O processo de recombinação funciona da mesma maneira que a
recombinação entre o vetor de entrada e o vetor de destinação do sistema GATEWAY®
(Figura 3.2).
FIGURA 3.2 – Esquema da recombinação mediada pela enzima LR Clonase. Modificado de: www.invitrogen.com.
O vetor pTcTAPN pode ser utilizado para a superexpressão das proteínas de
interesse, que são expressas fusionadas a uma etiqueta que pode ser utilizada também para
ensaios com estas proteínas. Neste estudo, a clonagem em vetor pTcTAPN visa verificar os
23
efeitos da superexpressão das proteínas de interesse e gerar uma ferramenta para posterior
confirmação dos dados de ribonômica. Será possível utilizar os TAGs para realizar a
precipitação dos complexos mRNA proteína contendo TcRRM2 ou Tc47.9 e analisar os
complexos através de uma técnica diferente da imunoprecipitação utilizando anticorpos,
como forma de confirmação dos resultados já obtidos.
3.2.2 Preparo de bactérias cálcio-competentes
O preparo das bactérias cálcio-competentes para transformação foi realizado
segundo SAMBROOK et al (2001). Uma colônia de bactéria E. coli da cepa DH5α foi inoculada
em 5 mL de meio Luria-Bertani (LB) e incubada sob agitação constante de 220 rpm por 16
horas a 37ºC. Foi adicionado 10 mL deste pré-inoculo a 100 mL de LB, e a cultura incubada
sob as mesmas condições anteriores até atingir a fase de crescimento exponencial (D.O. de
0,6). A cultura foi centrifugada a 4.000 x g por 5 minutos a 4ºC e as células foram suspensas
em 50 mL (metade do volume original) de solução gelada de CaCl2 100 mM em tampão
HEPES 10 mM pH 7,0 e mantidas por 30 minutos em gelo. A suspensão foi centrifugada e as
células foram ssuspensas em 2 mL (1/50 do volume da cultura original) da solução anterior
acrescida de 10% de glicerol. As células foram então mantidas em gelo seco por 2 horas,
aliquotadas e armazenadas a – 70ºC.
3.2.3 Transformação de bactérias cálcio-competentes
Os plasmídeos recombinados foram incubados com bactérias Escherichia coli cálcio-
competentes da cepa DH5α por 30 minutos a 4°C (0,1 μg de plasmídeo para 50 μL de E.coli),
permitindo a adsorção do DNA na superfície bacteriana. As bactérias foram então
submetidas a um choque térmico que permitiu a entrada dos plasmídeos (incubação a 42 ºC
por três minutos seguida de incubação em gelo por dois minutos). Após este tempo as
células foram incubadas sob agitação constante a 37ºC com meio de cultura LB sem
antibiótico, para que pudessem expressar os genes de resistência aos antibióticos antes de
serem colocadas em um meio seletivo sólido com antibióticos específicos para a seleção de
cada vetor utilizado (pDONR™221 – canamicina 50 μg/mL, pDEST™17 – ampicilina 100
μg/mL,pTcPRTAPN– ampicilina 100 μg/mL). As placas foram incubadas por 18 horas a 37 ºC
para o crescimento das colônias.
24