Co-cultura das CTMs transduzidas com Ad.RGD.CMV.LacZ (controle

AD.RGD.CMV.LACZ (CONTROLE NEGATIVO) E/OU AD.RGD.PG.IFNβ E/OU AD.RGD.PG.P19Arf _{COM B16-GFP}

No próximo passo, foi avaliada a influência de IFNβ sobre células tumorais no ensaio de co-cultura, mas neste caso a proporção foi de nove células tumorais para cada uma CTM. E ainda, foi explorada a possibilidade do p19Arf conferir sensibilização para as células tumorais frente sua exposição para IFNβ. Para isto, as CTMs foram transduzidas ou não com Ad.RGD.CMV.LacZ ou Ad.RGD.PG.IFNβ.

B16-GFP MS C - Con trol e MS C - LacZ 1000 MS C - LacZ 2000 MS C - IFN 1000 MS C - IFN 2000 0 50 100 150 200 *** *** 96 horas P o rc e n ta g e m d e c é lu la s B 1 6 -G F P ( n o rma li z a d a s p e lo c o n tr o le )

12C

Em paralelo, B16-GFP foram transduzidas ou não com Ad.RGD.CMV.LacZ ou Ad.RGD.PG.p19Arf. Logo em seguida, as co-culturas foram montadas na proporção 1:9 (CTM: B16-GFP) e incubadas. Replicatas foram fotografadas 24, 48 e 72 horas após montagem da co-cultura e contadas com o programa Image J. Como demonstrado na Figura 13, o número de células tumorais foi reduzido mesmo utilizando a proporção de 1:9 (CTM expressando IFNβ para B16-GFP). Também foi observado que p19Arf reduziu o número de células tumorais. Porém, a presença de p19Arf nas células tumorais deixou estas mais sensíveis à ação de IFNβ fornecida pelas CTMs.

Figura 13: Quantificação de B16-GFP a partir do ensaio de co-cultura. As

CTMs (MSC, mesechymal stem cells) foram transduzidas com Ad.RGD.CMV.LacZ (LacZ) ou Ad.RGD.PG.IFNβ (IFN). Em paralelo, células B16-GFP foram transduzidas com Ad.RGD.CMV.LacZ ou Ad.RGD.PG.p19Arf_{. Logo em seguida a}

co-cultura foi montada na proporção 1:9 (CTM:B16-GFP). As fotomicrografias foram realizadas com uso do microscópio EVOS FL (Thermo Fisher) utilizand o a objetiva de 10x. O número de células GFP-positivas (B16-GFP) foi quantificada com o programa Image J, e demonstrado no gráfico. Ressalta-se que os rótulos para cada linha se refere a condição de transdução das MSC que foram co-cultivadas com as células tumorais (B16-GFP). O experimento foi realizado em triplicata e utilizado o teste estatístico Student’s t-test, p<0,001.

5.10. HOMING DE CTMs AO SÍTIO TUMORAL

Em preparação para um ensaio in vivo e verificação da sensibilização de células tumorais a IFNβ expressa pelas CTMs, foi primeiramente explorado a infiltração de CTM em tumores B16. Para este ensaio piloto, células B16 -F10 foram

implantadas s.c. em camundongos C57BL/6 fêmeas e a formação do tumor foi observada. Assim que o tumor se tornou palpável, CTMs previamente transduzidas com Ad.RGD.PG.eGFP foram injetadas na veia caudal. Após 48 horas, os animais foram eutanasiados, os tumores recolhidos e processados para observação das células GFP-positivas, sendo as CTMs. Como demonstrado na Figura 14, pode-se afirmar a presença de CTM carreando o Ad.RGD.PG.eGFP, indicando que a CTM tem o potencial de migração ao foco tumoral nas condições utilizadas neste ensaio.

Figura 14: Corte transversal do tumor B16-F10 após injeção sistêmica de CTMs. Células B16-F10 foram injetadas via subcutânea em animais C57BL/6. Após

o tumor se tornar palpável, CTM transduzidas com Ad.RGD.CMV.LacZ ou Ad.RGD.PG.eGFP foram inoculadas via sistêmica. Após 48 horas, os animais foram eutanasiados e os tumores recolhidos, fixados e congelados. Cortes congelados foram corados com DAPI e observados em microscopia de fluorescência (EVOS FL, Thermo Fisher). a) Tumor B16-F10, animal tratado com CTM expressando LacZ. b) Tumor B16-F10, animal tratado com CTM expressando eGFP. Microscópio Evos, na objetiva de 10x.

6. DISCUSSÃO

O melanoma possui uma alta possibilidade de metástase, por isso é mais grave que os casos de câncer de pele não-melanoma. Um paciente em estágios avançados, tem em média uma sobrevida de 6 a 9 meses (57).

Quando diagnosticado precocemente, o tratamento do melanoma é através de excisão cirúrgica, casos mais avançados utiliza-se quimioterapia e radioterapia. A terapia sistêmica, como a quimioterapia, permanece insatisfatória, induzindo respostas duradouras completas em uma pequena minoria de pacientes. A quimioterapia atinge tanto as células em divisão quanto as tumorais, por isso pesquisadores buscam uma forma mais especifica de tratamento destinado apenas ao tumor [3].

O uso do IFNβ aliado à quimioterapia com o intuito de promover uma ativação da resposta adaptativa do sistema imune já foi um bom aliado em alguns tipos de melanoma, porém o tratamento com o interferon beta recombinante torna-se diversas vezes ineficaz por sua farmacocinética, por possuir uma baixa meia-vida na circulação, de aproximadamente, 5 minutos, além de muitos nódulos terem pouca vascularização, o que dificulta o acesso do IFN ao tumor. Outra desvantagem quanto ao uso do IFN são os efeitos colaterais, febre, calafrios, anorexia e fadiga progressiva, neutropenia, e/ou trombocitopenia; alguns receptores sofrem de mialgia e efeitos no sistema nervoso central. Estes efeitos tóxicos estão relacionados à intensidade do tratamento, dose, frequência da dosagem e duração (58).

Uma das formas de tratamento do melanoma e uma alternativa às desvantagens acima mencionadas é através do uso do adenovírus recombinante que expressa constitutivamente o IFNβ. O adenovírus é um dos vetores mais comumente usados na terapia gênica e bem explorado pelo grupo de vetores virais no ICESP-USP. A fibra Ad5 foi modificada com a inserção do tripeptídeo RGD, sendo capaz de infectar células que não expressam CAR, cerca de 100-1000 vezes mais eficiente do que o vírus contendo a fibra de tipo selvagem. Além da inserção do RGD, Bajgelman e Strauss (2008) desenvolveram um adenovírus com um promotor responsivo à p53, o que aumentou os níveis de expressão do transgene até 5 vezes mais do que visto com o promotor constitutivo. Para finalizar o vetor adenoviral, foi realizada a inserção dos transgenes que são o IFNβ, formando assim o vetor Ad.RGD.PG.IFNβ, e o p19Arf

imunomodulação, citotoxicidade e de supressor tumoral, atuando na inibição do crescimento celular descontrolado devido a ativação de oncogenes, ativando o fator de transcrição p53 e desencadeando a parada do ciclo celular (34).

No tabalho de Merkel (2013), a transferência in situ de um gene supressor de tumor (p19Arf) associado com um gene imuno modulador (IFNβ) tornou as células de melanoma murino mais susceptíveis à morte celular comparado com o tratamento isolado do Ad.PG.IFNβ e o Ad.PG.p19Arf _{tanto in vitro quando in vivo (29).}

Porém ao utilizar o vetor adenoviral como tratamento pela via sistêmica, a maior parte das partículas de vetores adenovirais, Ad5, são sequestrados para o fígado, os hepatócitos são facilmente transduzidos e/ou o vírus é fagocitado pelos macrófagos residentes no fígado, células de Kupffer (KCs), causando toxicidade, resposta inflamatória, e assim reduzindo a dose eficaz de vírus, restringindo o vetor adenoviral para protocolos clínicos (59).

Devido à alta taxa de inativação das partículas virais após inoculação sistêmica é necessário buscar alternativas capazes de mascarar essas partículas. Uma forma de mascarar e dirigir a partícula viral até o foco tumoral é utilizando a CTM. Estudos demonstraram que as CTMs são capazes de dar suporte a hematopoiese e podem modular respostas imunes. Interessantemente, CTMs exibem um comportamento dirigindo para o tecido danificado, locais inflamatórios, e locais de tumor. Outra característica das CTMs é a sua baixa imunogenicidade devido à falta de expressão de moléculas co-estimuladoras. Deste modo, as CTMs não ativam a resposta imunológica do hospedeiro. A atividade de direcionamento da CTM para o local do tumor facilita a sua utilização como veículos celulares para a distribuição de agentes anti-tumorais (54).

Porém as CTMs contribuem para o desenvolvimento tumoral através da supressão da resposta imune, promoção de metástase e mediação na transição epitélio- mesenquima (EMT), como dito anteriormente (54). Esse fato foi verificado por Studeny M. et al, (2002), o qual extraiu CTM-MO de indivíduos saudáveis, marcou com dye SP-Dil fluorescence e injetou CTM-MO mais A375SM (linhagem de câncer de pulmão) subcutâneamente em camundongos nudes. Verificou, assim, que as células tumorais induziam a proliferação das CTMs e que uma porção significativa das CTMs era incorporada na arquitetura tumoral, levando formação de cápsula fibrosa na periferia do tumor, contribuindo para a formação do estroma tumoral (60). As CTMs têm sido utilizadas como veículo de agentes terapêuticos, como IFN-β (em

câncer de pâncreas, próstata, mama e melanoma), TRAIL (utilizado em gliomas, câncer de pâncreas e metástase pulmona) e IL-12 (uso em carcinomas de células renais), tendo sua relevância devido ao seu potencial de migração ao sítio tumoral (61-65).

Com base na literatura isolamos células-tronco mesenquimais da medula óssea inicialmente para servirem como veículos para carrear os vetores adenovirais já utilizados no tratamento do melanoma murino, que são o Ad.RGD.PG.IFNβ e o Ad.RGD.PG.p19Arf.

O isolamento de CTM da medula óssea foi de fácil acesso e rápido, porém a cultura celular mesmo depois de diversas lavagens e passagens ainda não se apresentava pura, com a presença de muitas células hematopoiéticas. Pela baixa quantidade de CTM e alta quantidade de contaminantes a cultura tardou muito a desenvolver e proliferar. A frequência de CTM em MO é baixa, representa entre 0,001% a 0,01% da fração celular da MO. Com base no tempo de espera para estabelecer uma cultura pura, outra fonte de isolamento foi selecionada, a extração de CTM a partir do tecido adiposo, qual é 10 vezes mais abundante em CTM comparado ao de medula óssea. A extração foi bem simples, através da digestão com a colagenase tipo 1 e a cultura das células-tronco se desenvolveu mais rápido do que das CTM-MO, em 20 dias foi obtida uma cultura para prosseguir os experimentos (66-68).

Na caracterização das CTMs, tanto as extraídas da medula óssea quanto do tecido adiposo foram positivas para os marcadores Sca-1 e CD29 e negativas para os marcadores CD31, CD11b, CD45, em conformidade com a literatura. Infelizmente não existe um único marcador que comprove a presença das CTMs (48, 69).

Apesar da caracterização da CTM-MO ter saído conforme esperado, prosseguiu- se com o isolamento e cultura da CTM-TA pela sua proliferação mais ativa em comparação com a CTM-MO. Já que as CTM-TA desenvolvem mais rapidamente, comparamos a caracterização entre as passagens 3 e 8, e foi observado que a partir da 8ª passagem, as CTMs-TA começaram a perder a sua característica de tronco, o marcador SCA-1 começou a perder a sua positividade e o CD29 começou a se alterar, tornando-se mais positivo. Tais dados corroboram com os estudos de Mitchell J.B. et al (2006), que demonstraram que as características fenotípicas das CTM-TA mudam com sucessivas passagens, os marcadores associados ao estroma (CD13, CD29, CD44, CD63, CD73, CD90, CD166) são baixos, e aumentam significativamente no decorrer da cultura (70, 71).

Estudos recentes de Davies et al (2015), apontam que o aumento da população CD29+/CD90+ também está relacionado com a diminuição da expressão de genes responsáveis pela pluripotência das células tronco (Lin28, Sox2 e Nanog). Esses genes representam fatores de pluripotência requisitados na manutenção e no potencial de auto- renovação das células tronco, que podem ser transfectadas, juntamente com OCT4, para induzir reversão para um estado pluripotente induzido. Corroborando com esses dados de expressão gênica, Davies et al, também demonstrou que CD29+/CD90+ aumentou significativamente a capacidade de CTM-MO e CTM-TA para diferenciar em osteócitos/adipócitos, de acordo com o seu nicho, respectivamente. Tais resultados foram apresentados comparando as passagens 0 e 1 das CTM-MO e CTM-TA extraídas de camundongos. Tomando os achados de Davies como base para o nosso resultado, o aumento da positividade do CD29 (comparando o marcador na passagem 3 com a passagem 8) indica que a célula está perdendo a sua característica de tronco e possivelmente indo a um estágio de diferenciação. Assim foi evitado utilizar, nos experimentos posteriores, CTMs com altas passagens (72).

Com esse conjunto de dados relacionados à caracterização das mesenquimais, foi decidido trabalhar com até a 6ª passagem. Evitando assim perder a característica de tronco das CTMs.

Com o objetivo de testar o efeito biológico da CTM-TA frente aos adenovírus, foi desenvolvido o ensaio de eficiência de transdução, o qual apontou um MOI elevado, 1000 e 2000, para uma expressão satisfatória do gene eGFP. Porém, estudos feitos por Studeny M. et al (2002), o qual utilizou CTM-MO, extraídas de indivíduos saudáveis, como veículo para entrega de IFNβ humano para tratamento de metástases no pulmão, utilizou um MOI de 3000 do Ad5IFNβ, MOI considerado para ele satisfatório, para os experimentos. O mesmo MOI de estudo foi utilizado para transdução de CTM-TA por Lamfers M. et al (2009). Concluindo assim que as CTMs necessitam de um MOI elevado para expressam do transgene (60, 73).

Studeny M. et al (2002), também realizou o experimento de co-cultura, CTM-MO mais A375SM (câncer de pulmão). E percebeu que ao cultivar as A375SM com a CTM-MO transduzida com Ad5IFNβ no período total de 72h ocorria uma inibição de 50% do crescimento da célula tumoral, A375SM, comparado com o controle sem tratamento (CTM-MO não transduzida mais A375SM), e com a

A375SM cultivada sozinha, sendo que tal experimento foi analisado por citometria de fluxo (60).

Wang GX et al (2012), realizou co-cultura em um sistema de cultura transwell. A co-cultura de células PC-3 com CTM mais Ad5-IFN inibiu significativamente o crescimento das células PC-3 em comparação com co-cultura com CTMs transduzidas com vetor controle ou não modificadas (74).

No nosso experimento de co-cultura observamos resultados parecidos com Studeny M. et al, (2002) e Wang GX et al, (2012). O IFNβ (MOI 1000) inibiu o crescimento tumoral, das células B16, consideravelmente. Porém conseguimos uma porcentagem maior de inibição com o tratamento combinado, CTM transduzida com Ad.RGD.PG.IFNβ (MOI 500) + Ad.RGD.PG.lacZ (MOI 500) mais as células B16 sendo tratadas previamente com o Ad.RGD.PG.p19Arf (MOI 75).

Como base para o futuro experimento in vivo, o Wang GX et al (2012), utilizou duas doses de CTM-Ad5-IFNβ, 2×106 _{células/dose e 2×10}5 _{células/dose,}

administrada via sistêmica, para o tratamento de câncer de próstata, o qual foi induzido por células PC3. Ambas as doses prolongaram significativamente a sobrevida dos animais em comparação com os controles não tratados, porém não obteve diferença significativa entre as duas doses. Além disso, o tratamento com IFNβ recombinante, só o vírus Ad5-IFNβ, CTM transduzida com vetor controle ou só CTMs não obteve efeito significativo sobre a sobrevida dos animais em comparação com o controle não tratado. As suspensões de células e vírus foram injetadas por via intravenosa três vezes, em cada grupo em intervalos semanais, já o IFNβ recombinante foi injetado subcutaneamente a cada dois dias durante todo o experimento (74).

7. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS

Pode-se concluir que: a cultura das CTMs proveniente de medula óssea (CTM- MO) requer mais tempo para a obtenção de uma população “pura”, por conter mais contaminantes (diversos tipos celulares) em comparação com a cultura das CTMs extraídas de tecido adiposo (CTM-TA). Assim, optou-se por trabalhar com as CTM- TA. Com a caracterização realizada por citometria de fluxo observou-se que independente do local da extração, as CTM-TA apresentam os mesmos marcadores (anticorpos marcados como positivos e negativos) que as células CTM-MO. A caracterização através da diferenciação das CTMs através do meio de diferenciação específico, para a obtenção de adipócitos, condrócitos e osteócitos foi realizada e constatou que as CTM-TA têm capacidade de diferenciação condizente com células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo. Foi observado que as CTM-TA são de difícil transdução, por isso são necessários MOIs altos, comparado com outros tipos celulares. A transdução das CTM-TA com a combinação Ad.RGD.PG.IFNβ mais Ad.RGD.PG.p19Arf _{levou a uma modificação da morfologia celular das CTMs em 48h e}

72h após a transdução. No ensaio de co-cultura, a B16 foi cultivada com a CTM-TA transduzida com o vetor expressando IFNβ, o que reduziu o número de células tumorais, porém ao sensibilizar as células tumorais, B16, com p19Arf e cultivá-las com CTM-TA transduzida com o vetor expressando IFNβ houve uma redução de células tumorais ainda maior. No experimento in vivo, observou-se o sucesso que as CTM-TA transduzidas com vetor adenoviral expressando eGFP apresentaram tropismo ao sítio tumoral. Espera-se que na fase de experimentação in vivo, o tratamento das CTMs expressando o IFN-β, em conjunto com o tratamento in situ do Ad.RGD.PG.p19Arf, iniba a progressão tumoral, aumentando a eficiência do tratamento e diminuindo a probabilidade de o vetor ser neutralizado pelo sistema imune. Este estudo serve não só para implementar e padronizar a tecnologia das CTMs no Laboratório de Vetores Virais mas também abre a possibilidade de explorar a biologia destas como carreadora de vetores virais.

8. REFERÊNCIAS

1. (INCA) INdCJAGdS. 2013; Available from:

http://www.inca.gov.br/estimativa/2012/estimativa20122111.pdf.

2. Benjamin CL, Ananthaswamy HN. p53 and the pathogenesis of skin cancer. Toxicol Appl Pharmacol. 2007 Nov 1;224(3):241-8.

3. Gogas HJ, Kirkwood JM, Sondak VK. Chemotherapy for metastatic melanoma: time for a change? Cancer. 2007 Feb 1;109(3):455-64.

4. Verma IM, Somia N. Gene therapy -- promises, problems and prospects. Nature. 1997 Sep 18;389(6648):239-42.

5. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011 Mar 4;144(5):646-74.

6. Wiley. 2013; Available from: www.wiley.co.uk/genmed/clinical.

7. Garber K. China approves world's first oncolytic virus therapy for cancer treatment. J Natl Cancer Inst. 2006 Mar;98(5):298-300.

8. Khare R, Chen CY, Weaver EA, Barry MA. Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting. Curr Gene Ther. 2011 Aug;11(4):241-58.

9. Khare R, May SM, Vetrini F, Weaver EA, Palmer D, Rosewell A, et al. Generation of a Kupffer cell-evading adenovirus for systemic and liver-directed gene transfer. Mol Ther. 2011 Jul;19(7):1254-62.

10. ROWE WP, HUEBNER RJ, GILMORE LK, PARROTT RH, WARD TG. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proc Soc Exp Biol Med. 1953 Dec;84(3):570-3.

11. Russell WC. Adenoviruses: update on structure and function. J Gen Virol. 2009 Jan;90(Pt 1):1-20.

12. Duffy MR, Parker AL, Bradshaw AC, Baker AH. Manipulation of adenovirus interactions with host factors for gene therapy applications. Nanomedicine (Lond). 2012 Feb;7(2):271-88. 13. Russell WC. Update on adenovirus and its vectors. J Gen Virol. 2000 Nov;81(Pt 11):2573-604.

14. Roy-Chowdhury J, Horwitz MS. Evolution of adenoviruses as gene therapy vectors. Mol Ther. 2002 Apr;5(4):340-4.

15. Leppard KN. E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adeno-associated virus infections. J Gen Virol. 1997 Sep;78 ( Pt 9):2131-8.

16. Lichtenstein DL, Toth K, Doronin K, Tollefson AE, Wold WS. Functions and mechanisms of action of the adenovirus E3 proteins. Int Rev Immunol. 2004 2004 Jan-Apr;23(1-2):75-111. 17. Volpers C, Kochanek S. Adenoviral vectors for gene transfer and therapy. J Gene Med. 2004 Feb;6 Suppl 1:S164-71.

18. Chiou SK, Tseng CC, Rao L, White E. Functional complementation of the adenovirus E1B 19-kilodalton protein with Bcl-2 in the inhibition of apoptosis in infected cells. J Virol. 1994 Oct;68(10):6553-66.

19. Tollefson AE, Scaria A, Hermiston TW, Ryerse JS, Wold LJ, Wold WS. The adenovirus death protein (E3-11.6K) is required at very late stages of infection for efficient cell lysis and release of adenovirus from infected cells. J Virol. 1996 Apr;70(4):2296-306.

20. Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol. 1977 Jul;36(1):59-74.

21. Mizuguchi H, Koizumi N, Hosono T, Utoguchi N, Watanabe Y, Kay MA, et al. A simplified system for constructing recombinant adenoviral vectors containing heterologous peptides in the HI loop of their fiber knob. Gene Ther. 2001 May;8(9):730-5.

22. Hammer K, Kazcorowski A, Liu L, Behr M, Schemmer P, Herr I, et al. Engineered adenoviruses combine enhanced oncolysis with improved virus production by mesenchymal stromal carrier cells. Int J Cancer. 2015 Aug 15;137(4):978-90.

23. Kruse JP, Gu W. Modes of p53 regulation. Cell. 2009 May 15;137(4):609-22.

24. Pant V, Lozano G. Limiting the power of p53 through the ubiquitin proteasome pathway. Genes Dev. 2014 Aug;28(16):1739-51.

25. Shaw PH. The role of p53 in cell cycle regulation. Pathol Res Pract. 1996 Jul;192(7):669- 75.

26. Benchimol S. p53-dependent pathways of apoptosis. Cell Death Differ. 2001 Nov;8(11):1049-51.

27. Fridman JS, Lowe SW. Control of apoptosis by p53. Oncogene. 2003 Dec;22(56):9030- 40.

28. Llanos S, Clark PA, Rowe J, Peters G. Stabilization of p53 by p14ARF without relocation of MDM2 to the nucleolus. Nat Cell Biol. 2001 May;3(5):445-52.

29. Merkel CA, Medrano RF, Barauna VG, Strauss BE. Combined p19Arf and interferon- beta gene transfer enhances cell death of B16 melanoma in vitro and in vivo. Cancer Gene Ther. 2013 May;20(5):317-25.

30. Ozenne P, Eymin B, Brambilla E, Gazzeri S. The ARF tumor suppressor: structure, functions and status in cancer. Int J Cancer. 2010 Nov;127(10):2239-47.

31. Lozano G, Elledge SJ. p53 sends nucleotides to repair DNA. Nature. 2000 Mar;404(6773):24-5.

32. Moore L, Venkatachalam S, Vogel H, Watt JC, Wu CL, Steinman H, et al. Cooperativity of p19ARF, Mdm2, and p53 in murine tumorigenesis. Oncogene. 2003 Oct;22(49):7831-7. 33. Takaoka A, Hayakawa S, Yanai H, Stoiber D, Negishi H, Kikuchi H, et al. Integration of interferon-alpha/beta signalling to p53 responses in tumour suppression and antiviral defence. Nature. 2003;424(6948):516-23.

34. Bajgelman MC, Strauss BE. Development of an adenoviral vector with robust expression driven by p53. Virology. 2008 Feb 5;371(1):8-13.

35. Strauss BE, Bajgelman MC, Costanzi-Strauss E. A novel gene transfer strategy that