Co-expressão da LmRvb1 e LmRvb2 em um mesmo vetor de

Realizamos diversas tentativas para a remoção da cauda de histidina das LmRvbs clonadas nos vetores pET28a e pET15b utilizando a protease trombina. Mas, sem sucesso, esta enzima clivou em regiões não-específicas das LmRvbs e não foi capaz de remover esta cauda (dados não mostrados). Com isso, realizamos a expressão das proteínas de L. major no vetor de expressão pCOLA, que contém promotores individualizados e é bastante utilizado para co-expressar proteínas que possivelmente formam complexos. Neste vetor, apenas a LmRvb1 possui cauda de histidina e esta cauda pode ser removida por uma protease mais específica, a TEV protease.

A expressão destas proteínas foi realizada em células da cepa de bactérias BL21 (DE3) ArcticExpress, com indução a 12 °C. Alíquotas foram removidas em tempos que variaram de 2 a 24 horas e analisadas por SDS-PAGE (Figura 66) e após a indução de 24 horas, esta cultura foi centrifugada e as células foram congeladas para a primeira etapa de purificação por afinidade ao níquel.

Como estas proteínas possuem massa molecular teórica idêntica de 53 kDa quando expressas neste vetor, foi observada apenas uma banda de expressão com uma massa molecular aparente de aproximadamente 55 kDa (Figura 67), indicação com uma seta). Além disso, foi possível obter grande parte destas proteínas na porção solúvel em todos os tempos de indução testados (S da figura 67).

Figura 66. Gel de SDS-PAGE com as amostras da expressão da proteína LmRvb1/Rvb2 em vetor pCOLA. A expressão foi feita em células de BL21 (DE3) ArcticExpress nas condições de 0,5 L de cultura, a 12°C, 1 mM de IPTG, nos tempos de 2-24 horas de indução. MM = massa molecular padrão Broad range; NI = não induzido; T = total; S = sobrenadante; P = precipitado. Setas: Cpn60, chaperonina que é normalmente expressa pela cepa BL21 (DE3) ArcticExpress para auxiliar na solubilização da proteína recombinante; e, LmRvb1/Rvb2 com cerca de 53 kDa. O sobrenadante do tempo de 24 horas foi utilizado para o primeiro passo de purificação.

Sendo assim, o sobrenadante da lise de bactérias do tempo de 24 horas de indução (indicado com uma caixa vermelha na figura 66) foi injetado em uma coluna cromatográfica de afinidade ao níquel (Input da figura 67). É importante ressaltar que, nesta expressão, apenas a proteína LmRvb1 possui cauda de histidina na região N- terminal. Com isso, foi observada a presença de proteínas que interagiram com a resina na eluição com 500 mM de imidazol (Figura 67, caixa vermelha).

Figura 67. SDS-PAGE 10 % com amostras da cromatografia por afinidade ao níquel das proteínas co-expressas LmRvb1/Rvb2 em vetor pCOLA. A co-expressão das proteínas LmRvb1/Rvb2 foi realizada em BL21 (DE3) ArcticExpress em 0,5 L de cultura, 12 °C, 24 horas de indução com 1 mM de IPTG. MM = massa molecular padrão Broad range prestained; Input = sobrenadante filtrado após a lise das bactérias; FT = o que eluiu diretamente pela coluna; Lavagem = lavagem com tampão A (TrisHCl 25 mM, NaCl 500 mM, pH 8); Imidazol 40 mM = lavagem com tampão A com imidazol 40 mM; Imidazol 500 mM = eluição com tampão A com imidazol 500 mM (cerca de 15 mL de amostra). A caixa vermelha indica a amostra que foi utilizada para o experimento de desenovelamento induzido por ureia.

Devido a dificuldade em observar as duas proteínas na amostra eluída do primeiro passo de purificação, seguimos com um experimento de desenovelamento induzido por ureia. A amostra indicada com uma caixa vermelha da figura 67 foi dialisada em tampão sem imidazol e, em seguida, a ureia foi adicionada em uma concentração final de 8 M, para desenovelar totalmente as proteínas e ocasionando a desestruturação de possíveis interações. Logo, as proteínas desenoveladas foram injetadas novamente em uma cromatografia por afinidade ao níquel (Figura 68).

Figura 68. SDS-PAGE 10 % com amostras da cromatografia por afinidade ao níquel das proteínas co-expressas LmRvb1/Rvb2 em vetor pCOLA após desenovelamento induzido por ureia. Input = amostra proveniente da cromatografia por afinidade ao níquel, após o desenovelamento na presença de ureia. FT = o que eluiu diretamente pela coluna; Lavagem = lavagem com tampão A (TrisHCl 25 mM, NaCl 500 mM, pH 8); Imidazol 500 mM = eluição com tampão A com imidazol 500 mM (cerca de 15 mL de amostra). Observamos a presença da proteína LmRvb1 na amostra que eluiu com imidazol, mas ocorreu uma pequena expressão da LmRvb2, como notado nas amostras FT. Com isso, constatamos que a expressão destas proteínas em vetor pCOLA não decorreu de forma homogênea.

Pôde-se notar que a proteína LmRvb1 foi expressa em grande quantidade pois interagiu com a resina e foi eluída com 500 mM de imidazol (figura 68). Apesar disso, a LmRvb2 foi expressa em uma quantidade muito pequena e eluíram diretamente através da coluna (FT da figura 68). Este resultado demonstra que a expressão destas proteínas em vetor pCOLA não ocorreu de forma homogênea e por isso, não foi possível continuar os experimentos utilizando esta co-expressão.

Portanto, para os experimentos de atividade ATPásica a seguir, foram utilizadas as proteínas purificadas individualmente e o dímero formado pela co- expressão a partir dos vetores pET28a e pET15b.

3.4.5 Atividade ATPásica

As LmRvbs são membros da família de proteínas AAA+ e, portanto, espera-se que sejam ATPases ativas. Com isso, avaliamos a taxa de hidrólise do ATP através da oxidação do NADH (ver item 3.3.13). As reações foram

avaliadas em função do tempo e a taxa de hidrólise do ATP foi calculada para se obter um gráfico com a quantidade de fosfato inorgânico (em pmol) liberado por minuto para cada pmol de proteína em estudo (Figura 69). Apesar de não termos observado atividade ATPásica da LmRvb1, a LmRvb2 sozinha e o complexo LmRvb1/Rvb2 foram ATPases ativas e as taxas de hidrólise do ATP observadas entre estas proteínas foram muito semelhantes (Figura 69).

Figura 69. Taxa de hidrólise do ATP pelas proteínas LmRvbs. Para determinação da taxa de hidrólise do ATP das reações, a oxidação do NADH em função do tempo foi monitorada (ver item 3.3.13). Como controle negativo foi utilizada a proteína padrão BSA, que não possui atividade ATPásica, na mesma concentração das proteínas de estudo (5 µM). Pôde-se observar que a LmRvb1 não possui atividade ATPásica, assim como a BSA. Já as proteínas LmRvb2 sozinha e o complexo LmRvb1/Rvb2 foram ATPases ativas.

De forma resumida, estão apresentados tabela 10 os resultados que mostram as principais características das proteínas LmRvbs estudadas neste trabalho.

Tabela 10. Resumo das características observadas das proteínas LmRvbs durante a caracterização conformacional e funcional.

Proteína Raio hidrodinâmico (Å) Tm (° C) Centro de massa de fluorescência do triptofano (nm) MM em solução (kDa)/estado oligomérico Atividade ATPásica (pmol de Pi/ min/ pmol de proteína) LmRvb1 59 ± 1 62 ± 1 --- 276 ± 1 / Pentâmero Ausência LmRvb2 --- 70 ± 1 348 Oligômero > 10 mil kDa 12,2 ± 3,1 LmRvb1/Rvb2 49 ± 1 79 ± 1 350 99 ± 5 / Dímero 8,2 ± 1,5 3.4.6 Discussão

Avaliamos neste trabalho se a conformação e função das Rvbs do protozoário L. major são similares àquelas descritas para outros organismos. Para isso, as LmRvbs foram purificadas utilizando o sistema de expressão bacteriano que é uma metodologia bastante utilizada em laboratórios de purificação de proteínas por ser mais simples e consequentemente menos onerosa. Contudo, para se obter a melhor condição possível em termos de solubilidade e rendimento, a expressão da proteína de interesse deve ser testada em diferentes cepas de bactérias e condições de crescimento. Ainda que laboriosos, o estabelecimento desta metodologia é primordial para o estudo da relação estrutura/função das proteínas.

Foram utilizadas diferentes cepas de bactérias para tentar obter as proteínas LmRvbs na fração solúvel. Isto porque é imprescindível que uma proteína em solução esteja solúvel para os experimentos de caracterização. Com sucesso, a cepa BL21 (DE3) Arctic Express foi capaz de solubilizar grande parte das LmRvbs e assim foi possível compreender parte da conformação e função destas proteínas. De maneira similar, as Rvbs provenientes do protozoário P. falciparum também foram de difícil solubilização (AHMAD et al., 2012; AHMAD; TUTEJA, 2013b) quando comparadas com as purificações das proteínas de leveduras e humanos (GORYNIA et al., 2011; GRIBUN et al., 2008; KANEMAKI et al., 1999; MATIAS et al., 2006; PURI et al., 2007; TORREIRA et al., 2008). A proteína Rvb3 (análogo da Rvb2) de P. falciparum, por exemplo, foi purificada a partir da metodologia de re-enovelamento utilizando a ureia como agente desnaturante (AHMAD et al., 2012). Em outro estudo, a proteína Rvb1

deste mesmo organismo foi purificada utilizando uma metodologia de choque térmico antes do processo de indução da proteína, para tentar recrutar maior quantidade de chaperonas que auxiliam no correto enovelamento (AHMAD; TUTEJA, 2013b; CURTI; SMERDON; DAVIS, 2007).

Neste trabalho, tanto a proteína LmRvb1 como a LmRvb2 foram purificadas com sucesso a partir da porção solúvel do extrato bacteriano. No primeiro passo de purificação por cromatografia de afinidade ao níquel, estas proteínas foram capazes de interagir com o níquel coordenado na resina e foram purificadas individualmente. Além disso, a cromatografia de exclusão por tamanho foi utilizada para separar diferentes estados oligoméricos das amostras de proteínas. A proteína LmRvb1 apresentou características positivas durante seu manuseio como se manter estável durante o processo de concentração, por exemplo. Já a LmRvb2 demonstrou ser uma proteína que precipita facilmente e/ou agrega em solução.

Com a proteína LmRvb1 pura e enovelada, foi observada a presença de apenas uma espécie oligomérica composta de cinco subunidades, formando um pentâmero em solução. Apesar deste resultado não corroborar perfeitamente com a literatura que relata a formação de hexâmeros (GORYNIA et al., 2011; MATIAS et al., 2006), a organização deste oligômero parece ser bastante estável nas condições estudadas. Já a proteína LmRvb2 apresentou características de um grande oligômero em solução. Isto porque não obtivemos sucesso na separação dos diferentes estados oligoméricos devido ao baixo rendimento da LmRvb2. Além disso, durante o processo de concentração desta amostra, ocorreu agregação e precipitação de proteínas.

A partir dos dados da espectropolarimetria de dicroísmo circular, observamos que tanto a LmRvb1 como a LmRvb2 possuem perfil de uma proteína que contém hélices α. De fato, a estrutura cristalográfica da Rvb1 humana demonstrou que o monômero possui 14 hélices α, 16 folhas β e 2 hélices do tipo 310 (MATIAS et al.,

2006). As hélices α se destacam no perfil do espectro de dicroísmo circular pois a conformação desta estrutura é mais constante entre as proteínas quando comparada com as folhas β que podem formar diferentes conformações como pararela, anti-paralela ou uma mistura (CORREA; RAMOS, 2009). Além disso, durante o desenovelamento induzido, ambas as proteínas LmRvbs apresentaram características de uma proteína enovelada pois, ao decorrer do ensaio, foram observadas transições com perfil cooperativo entre o estado enovelado e desenovelado (CORREA; RAMOS, 2009; RAMOS; FERREIRA, 2005).

Alguns experimentos não foram possíveis de serem realizados com a proteína LmRvb2 devido a sua grande massa molecular. Realmente, o resultado do coeficiente de difusão desta proteína pode indicar a formação de um oligômero como massa maior que 10 mil kDa em solução. Os parâmetros hidrodinâmicos obtidos para a LmRvb1 demonstraram que esta proteína possui uma conformação não-esférica. Isso foi observado para as proteínas de leveduras e humanos, pois a formação dos oligômeros se dá pela organização na forma de “anel” contendo um canal central, indicando uma estrutura mais alongada do que globular (GRIBUN et al., 2008; MATIAS et al., 2006; PETUKHOV et al., 2012).

Como na literatura tem sido descrito sobre a interação entre as proteínas Rvb1 e Rvb2 em diferentes organismos (GORYNIA et al., 2011; GRIBUN et al., 2008; TORREIRA et al., 2008), decidimos co-expressar estas proteínas. Também, a difícil caracterização da proteína LmRvb2 apontou para a hipótese de que esta proteína necessita da interação com a proteína LmRvb1 para seu correto enovelamento. De fato, foi observado na cromatografia de exclusão por tamanho a formação de diferentes estados oligoméricos quando estas proteínas foram co-expressas e, interessantemente, tanto a proteína LmRvb1 quanto a LmRvb2 deslocaram conjuntamente seu volume de eluição, o que indica interação entre estas proteínas.

Além disso, a co-expressão das Rvbs modificou a estabilidade das proteínas expressas individualmente pois ocorreu um aumento da temperatura no ponto médio da transição durante o desenovelamento induzido por temperatura. Tal aumento é indicativo de formação energeticamente favorável do complexo. Este aumento de estabilidade também foi observado nas Rvbs do fungo Chaetomium thermophilum, onde as proteínas individualizadas possuem menor Tm (43 °C para Rvb1 e 62 °C para Rvb2) que o complexo hetero-dodecamérico (67 °C) (SILVA-MARTIN et al., 2016).

Utilizando o equipamento de SEC-MALS constatamos a formação de um dímero pela LmRvb1/Rvb2 ao seu utilizar a estratégia de co-expressão. Quando comparado com a LmRvb1 isolada, este dímero possui menor raio hidrodinâmico, ou seja, possui uma conformação mais compacta por ser menor. Estes resultados sugerem, portanto, que o complexo LmRvb1/Rvb2 possui menor massa molecular que o pentâmero de LmRvb1. Além disso, os experimentos de fluorescência intrínseca do triptofano demonstraram que a emissão de fluorescência dos resíduos da proteína LmRvb2 foi deslocada quando as proteínas foram co-expressas. Esta análise foi facilitada pela ausência de triptofanos na sequência de aminoácidos da LmRvb1, pois a

mudança no espectro de emissão do triptofano se refere apenas a modificação no ambiente do triptofano da LmRvb2. Concluímos então que as proteínas formam um complexo quando co-expressas na célula de bactéria e que a estrutura da LmRvb2 pôde ser estabilizada pela presença da LmRvb1.

Para tentar encontrar a melhor conformação das proteínas LmRvbs, realizamos diversas estratégias para a remoção da cauda de histidina destas proteínas. Mas, não obtivemos sucesso nestes experimentos. Apesar disso, na literatura existem diversos exemplos de Rvbs que possuem ou não cauda de histidina e em alguns casos foi observada influência desta cauda na oligomerização (GRIBUN et al., 2008; JEGANATHAN et al., 2015; MATIAS et al., 2006; PURI et al., 2007).

Já foi relatado, por exemplo, no laboratório de Cheung e colaboradores (2010) que as proteínas de leveduras, na presença da cauda de histidina, formaram um dímero em solução e, na ausência desta cauda, ocorreu a formação do hexâmero. Outros estudos realizaram testes com as proteínas de leveduras observando a oligomerização quando somente a Rvb1, ou somente a Rvb2 ou as duas proteínas possuíam cauda de histidina (CHEUNG et al., 2010b; JEGANATHAN et al., 2015). Quando somente uma das proteínas continham cauda, foi observada formação tanto de hexâmeros quanto de dodecâmeros (CHEUNG et al., 2010b; JEGANATHAN et al., 2015; TORREIRA et al., 2008). Mas, a expressão de ambas proteínas com caudas formaram predominantemente dodecâmeros (CHEUNG et al., 2010b; JEGANATHAN et al., 2015).

No entanto, a Rvb1 humana foi purificada contendo a cauda de histidina e foi cristalizada como hexâmero (MATIAS et al., 2006). Com isso, concluímos que as diferentes conformações das LmRvbs também devem ser avaliadas na presença e na ausência da cauda de histidina, para poder descartar a possibilidade de que as caudas possam estar induzindo estados conformacionais e oligoméricos não-fisiológicos.

Além da caracterização conformacional das LmRvbs, a atividade enzimática foi imprescindível para compreender a relação entre estrutura e função. Nossos experimentos de atividade ATPásica demonstraram que a LmRvb2 e o complexo LmRvb/Rvb2 são enzimas ativas. Já a LmRvb1 não manifestou atividade ATPásica, assim como foi observado com a Rvb1 humana, que também possui baixa atividade in vitro (MATIAS et al., 2006). Apesar disso, sugere-se que esta baixa atividade da Rvb1 humana é devido a presença de ADP, pois esta molécula interage fortemente com o sítio ativo desta enzima (MATIAS et al., 2006). Também em humanos foi observado que as

duas proteínas necessitam estar presentes para que a hidrólise do ATP seja efetiva (PURI et al., 2007).

Já em leveduras ocorre o inverso pois a Rvb1 possui maior atividade que a Rvb2 (GRIBUN et al., 2008). No entanto, o complexo Rvb1/Rvb2 continua sendo mais ativo (GRIBUN et al., 2008). Em protozoários as proteínas Rvb2 e o complexo Rvb2/Rvb3 também possuem atividade ATPásica, mas não é clara a diferença na hidrólise do ATP entre o complexo e a proteína individualizada (AHMAD; TUTEJA, 2013a).

Existem exemplos de proteínas helicases da família AAA+ em eucariotos que possuem pouca ou nenhuma atividade ATPásica, mas a atividade é significativamente maior quando fazem parte de um complexo com seis, três ou duas subunidades (DAVEY; INDIANI; O’DONNELL, 2003). De fato, a hidrólise do ATP na proteína RuvB de bactérias acontece na interface das subunidades pois ocorre a formação de uma região favorável para a catálise (HISHIDA et al., 2004).

Assim, como observado para as proteínas LmRvbs, acreditamos que as diferentes características estruturais e funcionais observadas entre os organismos podem estar relacionadas com fatores celulares individuais. Em células de parasitas do gênero Leishmania, por exemplo, ocorrem complexas diferenciações celulares durante seu ciclo de vida que são desencadeadas por modificações ao nível molecular e por um controle intracelular ordenado para que este organismo possa se desenvolver em diferentes hospedeiros (DE PABLOS; FERREIRA; WALRAD, 2016; DILLON et al., 2015). Deste modo, os resultados obtidos neste trabalho podem contribuir fortemente para o desenvolvimento de novas estratégias de intervenção e compreensão do papel das Rvbs em protozoários.

3.4.7 Conclusões

✓ As proteínas LmRvb1 e LmRvb2 se encontram da fração solúvel quando expressas em BL21 (DE3) ArcticExpress;

✓ Estas proteínas foram purificadas com alto grau de pureza (>90 %) em apenas dois passos cromatográficos;

✓ Os experimentos de dicroísmo circular indicam que estas proteínas se encontram enoveladas após a purificação;

✓ Nas condições testadas, a proteína LmRvb1 forma um pentâmero em solução, a Rvb2 forma um grande oligômero e as proteínas LmRvb1/Rvb2 co-expressas com cauda de histidina formam um dímero em solução;

✓ A LmRvb1 não possui atividade ATPásica, mas a LmRvb2 e o complexo LmRvb1/Rvb2 são enzimas ativas.

4. Perspectivas futuras

Nosso grupo de pesquisa realizou diversas tentativas para purificar a proteína ANKCLP humana de forma heteróloga, mas infelizmente não obtivemos sucesso pois esta proteína não estava presente na fração solúvel. Os próximos passos poderiam ser direcionados para a clonagem em vetores que contenham caudas que codificam outras proteínas que auxiliam no processo de solubilização durante a expressão. Com um alto rendimento na purificação, a função desta proteína poderia ser avaliada in vitro. Além disso, com este trabalho observamos que esta função pode ser dependente de outros co-fatores ou proteínas que estão ausentes em leveduras e, outro modelo de organismo como o zebra-fish, por exemplo, poderia demonstrar sua função celular.

Em relação as Rvbs, será importante avaliar o estado oligomérico destas proteínas na ausência da cauda de histidina. Neste caso também poderia ser utilizado vetores que contenham caudas de proteínas, que pode facilitar a remoção destas caudas com as proteases específicas. Outro interesse no estudo das Rvbs, é a interação com as proteínas Tah1, Pih1 e Hsp90 do complexo R2TP. As proteínas Tah1 e Pih1 de L. major estão sendo caracterizadas em nosso grupo de pesquisa, ampliando possíveis novos estudos de interação entre estas proteínas.

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