(COL): DOCUMENTOS COMPLEMENTARES

Les effets de l'AMPc sur la régulation génique, dans les pre­ mières années de leur étude, paraissaient découler de quelques mécanismes simples. Dans la suite, le modèle s’est abondainment compliqué, et pose aujourd'hui plus de questions qu'il

n'apporte de réponses. Une manière de résumer les connaissances actuelles est de présenter d'abord le modèle simpliste, et

ensuite de détailler les acquisitions récentes.

Ce modèle pourrait s'énoncer comme suit; la protéine kinase A, activée par l'AMPc, phosphoryle un facteur nucléaire (le CREE, sur le résidu sérine en position 133), et celui-ci active la transcription a partir de son site de liaison spécifique dont le consensus (TAGCGTCA) est appelé CRE (Cyclic AMP Responsive Elément). Le CREE se lie a l'ADN sous forme de dimère même en l'absence de phosphorylation, et cette dernière induit une modification stérique de la molécule qui la rend activatrice.

Le motif CRE, découvert historiquement dans un enhancer de gène de pro-enképhaline (Comb et al.1986), fut identifié par la suite dans les promoteurs proches de plusieurs gènes présentant les caractéristiques communes d'être activés rapidement par l'AMPc au niveau transcriptionnel (activation maximale en 30 minutes pour le gène de la phospho-énol pyruvate carboxykinase

(PEPCK) par exemple), et ce de façon indépendante de la

synthèse protéique concomitante: ces gènes furent dits de type I, le type II représentant les gènes montrant une activation transcriptionnelle par l'AMPc plus lente (quelques heures) et nécessitant une synthèse protéique continue.

Le modèle simple décrit ci-dessus rend bien compte de l’acti­ vation rapide des gènes de type I. Quant aux gènes de type II, leur stimulation transcriptionnelle s'explique le plus simple­ ment par 1'induction de la biosynthèse préalable d'un facteur

intermédiaire dont le gène possède lui-même un CRE en cis (Roesler et al.1988). Le facteur AP-2, capable de transduire les effets transcriptionnels de l'AMPc comme des esters de

phorbol, venait à la rescousse dans les cas plus rares de gènes de type I ne possédant pas de CRE ( Imagawa et al. 1987 ; Roesler

et al.1988).

L'hypothèse de la phosphorylation d'un facteur pré-existant fut rapidement confirmée. Deux groupes clouèrent indépendamment une protéine baptisée CRE-Binding (CREE), l'un par criblage d'une banque d'expression de cDNA placentaire humain (Hoeffler et al.1988), l'autre à partir d'une lignée surrénalienne de rat après microséquençage partiel de la protéine caractérisée dans le cortex [de rat] (Yamamoto et al.1988; Gonzalez et al.1989).

La protéine placentaire représentait 1'homologue humain de la protéine de rat moins 14 acides aminés, résultant de l'épissage alternatif d'un seul gène rebaptisé CREB-327/341 (Hoeffler et al.1990). L'épissage alternatif fut d'ailleurs retrouvé chez le rat, générant par délétion des 14 acides aminés un facteur 10 fois moins actif (dans des cellules F9 de tératocarcinome co­ transfectées par la sous-unité catalytique de la PKa), et pou­ vant donc constituer un mécanisme de modulation de l'expression des gènes de type I.

La structure primaire de la protéine CREB-341/327 prédite par la séquence des ADNc correspondants contenait un consensus

unique de phosphorylation par la PKa, Arg-Arg-Pro-Serj^23^ ü fut démontré que celui-ci était effectivement phosphorylé in vivo, cette étape étant nécessaire à l'activation transcrip­ tionnelle, et impliquant probablement un mécanisme allostérique puisque le simple apport d'une charge négative en position 133 par mutagénèse dirigée de la Sér en Asp ne reproduisait pas l'effet de la phosphorylation (Gonzalez & Montminy 1989).

D'ailleurs, la dimérisation du CREE et sa liaison au CRE (Yamamoto et al.1988) ne nécessite pas sa phosphorylation préalable (Gonzalez & Montminy 1989) et, dans certains cas au moins, la liaison à l'ADN peut inhiber la transcription et

l'activer après phosphorylation (Lamph et al.1990), cette étape impliquant donc la translocation dans le noyau de la sous-unité catalytique de la PKa. Cette observation d'une régulation néga­ tive ou positive par le même facteur, tout comme la présence de sites de liaison mutuellement exclusifs pour des facteurs

complexes.

C'est la PKa de type II qui semble impliquée dans la régula­ tion transcriptionnelle, du moins au niveau du promoteur de la somatostatine (Montminy et al.1986; Tortora & Cho-Chung 1990).

La très élégante observation de l'expression différentielle de transgènes humain et bovin de sous-unité alpha d'hormones glycoprotéiques dans le placenta et 1'hypophyse de souris impliquait l'existence de facteurs trans tissu-spécifiques, soit une famille de facteurs CREE, soit les produits de gènes non-apparentés (Bokar et al.1989).

De fait, outre les ATF (voir ci-dessous), de nombreux fac­ teurs étaient découverts, dont certaines caractéristiques comme le poids moléculaire indiquaient clairement qu'ils n'étaient pas apparentés au CREE; CRE-EPl, par exemple (Maekawa et al. 1989), ou CREE-120K qui paraît 3 x plus lourd que CREE-341/327 en gel SDS (Andrisani & Dixon 1990). Bien que le gène du CREB- 341/327 ait pu être assigné au chromosome 2 chez l'homme, des études par Southern et Southwestern blots montrent qu'il existe une famille de protéines CREE codées par des gènes et/ou des messagers différents; le CRE-BPl, par contre, semble le produit d'un messager unique codé par un gène unique (Hoeffler 1990).

Simplification appréciable, la famille des ATF (Activating Transcription Factors) décrite a partir de la lignée HeLa, semblait correspondre aux CREBs (Hurst et al.1990), à

l'exception d'ATF2 correspondant au CRE-BPl; une liste

partielle de la famille est reprise dans le tableau suivant (adapté de Habener 1990).

quelques facteurs nucléaires reconnaissant le consensus CRE (TGAC6TCA)

CREE 327/341 s ATF-1 38-42 kDa

CRE-BPl = ATF-2 68-72 kDa

CREB-120K 120 kDa

La découverte du facteur CREM, Modulateur de la transcription reconnaissant le même consensus et inhibant la transcription induite par le CREE, mettait à jour un nouvel élément de régu­ lation d'autant plus puissante que le CREM présente divers transcrits exprimés de façon tissu-spécifique et présentant très probablement des demi-vies de messagers très différentes

(Foulkes et al.1991).

Tous les facteurs cités ci-dessus contiennent des hélices présentant des résidus leucine régulièrement espacés, dont 1'entremortaisement précis (Leu zippers) est nécessaire à la dimérisation. Le CREB-341/327 possède les deux fonctions de liaison à l'ADN par un domaine basique adjacent aux hélices à leucines (bZIP) (Habener 1990), et d'activation directe de la machinerie transcriptionnelle de base, probablement par le biais d'un domaine riche en résidus acides (Yamamoto et

al.1990). Les facteurs bZIP peuvent former soit des homo-, soit des hétéro-dimères suivant des critères bien précis de sélecti­ vité, et c'est finalement le type de dimère formé qui dicte la spécificité de liaison à l'ADN (Kouzarides & Ziff 1989). Le facteur AP-1, par exemple, résulte de 1'homodimérisation de certaines molécules de la famille Jun, ou plus volontiers de leur hétérodimérisation, avec certaines molécules de la famille Fos, conduisant à la spécificité du dimère pour l'élément de réponse aux esters de phorbol TRE (TPA Responsive Elément), dont le consensus TGACTCA est d'ailleurs très proche du GRE.

L'inexistence des hétérodimères Fos ou Jun/CREB explique dans le modèle simpliste la nette séparation des deux voies de