Colheita e Maturação dos oócitos

Os oócitos foram obtidos a partir de ovários de abatedouro. Os ovários foram lavados e transportados em solução salina (NaCl) a 0,9%, aquecida a 36ºC e acrescida de penicilina e estreptomicina.

A colheita dos oócitos será realizada através da aspiração de folículos com diâmetro entre 2 e 8 mm. Os oócitos que apresentarem aspecto homogêneo do citoplasma e compactação das células do cumulus, com duas a três camadas de células de revestimento foram selecionados.

Os oócitos selecionados foram maturados em estufa a 38,5 º C, com 5% de CO2

em ar por 22 a 24 h em gotas de 100uL (20 oócitos). Foi utilizado o meio TCM 199 com sais de Earle e L-glutamina suplementado com 10% SFB, 0,2 mM piruvato de sódio, 1 ug/mL estradiol, 50 μg/mL hCG, 5μg/mL FSH e 100 mg/mL de estreptomicina e 100 UI/mL de penicilina.

1.2. - Fertilização in vitro (FIV)

Após a maturação, oócitos foram submetidos à FIV. O sêmen foi preparado por centrifugação em gradiente de Percoll de 45 e 90%. A concentração foi ajustada para 2x106 espermatozóides/mL. A fertilização ocorreu em meio HTF (Irvine Scientific) acrescido de 6mg/mL de BSA, 0,2mM de piruvato, 30ug/mL de heparina, 18uM de penicilamina, 10uM de hipotaurina, e 1,8uM de epinefrina, 100 mg/mL de estreptomicina e 100 UI/mL de penicilina. Oócitos e espermatozóides foram incubados em gotas de 90uL (25 oócitos) em estufa a 5% CO2 em ar por aproximadamente 18 h.

1.3.- Cultivo in vitro

Decorridas as 18 h de FIV, os possíveis zigotos foram denudados e cultivados em meio SOFaa com 2,7mM de mio-inositol, 0,2 mM de piruvato, 5mg/mL de BSA, 100 mg/mL de estreptomicina, 100 UI/mL de penicilina e 2,5% de soro fetal bovino.

Todos os embriões foram cultivados em gotas de 100uL (20 oócitos/gota) cobertos com óleo mineral em estufa com 5% de CO2, 5% O2 e 90% N2. Após 72 horas a

clivagem foi avaliada, as estruturas que não estavam clivadas foram descartadas. Os embriões foram transferidos para outras gotas de 100uL contendo MB idêntico ao meio de cultivo. Cinco dias após a fertilização, 80 uL do meio de cultivo foi retirado e substituído por meio recém preparado. Sete dias após a FIV a formação de blastocistos foi avaliada. Aos nove dias de cultivo, os embriões foram utilizados para análise por imunocitoquímica ou tiveram sua massa celular interna individualizada para cultivo das CTE.

2. Isolamento das células tronco embrionárias

2.1. Preparo das células de sustentação (Monocamada):

Foram coletadas amostras com aproximadamente 1mm3 _{de tecido epitelial de}

fetos bovinos, as quais foram lavadas em solução fisiológica por duas vezes, e colocadas em frasco de transporte contendo meio de Eagle modificado por Dulbecco’s (DMEM, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA) em temperatura ambiente.

As amostras foram processadas em placas de Petri (de 60mm de diâmetro) contendo meio de cultivo. O tecido foi fragmentado em pedaços diminutos (média de 0,1 mm2cada pedaço) com o auxilio de duas lâminas 11 de bisturi tipo Bard-Paker. Os fragmentos foram lavados duas vezes com solução tampão fosfato sem cálcio e magnésio (PBSA), com pH 7,2 e posteriormente por solução de tripsina a 0,25% em PBSA e 1% de EDTA para obter a individualização celular.

Foi utilizado o meio de cultivo DMEM. Os fragmentos foram semeados distribuindo a suspensão celular em quatro frascos de cultivo de 25cm2 _{e incubados}

durante meia hora em estufa a 37ºC em atmosfera úmida contendo 95% de ar e 5%CO2, para favorecer sua adesão à superfície. Após esse tempo foi adicionado cerca de 3 ml de meio fresco em cada frasco, contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de solução antibiótica-antimicótica.

Os frascos foram devidamente identificados, datados e levados à estufa de cultivo com as tampas semi-abertas.

A monitoração do crescimento celular e de sua evolução foi feita a cada 24 horas utilizando-se microscópio de observação direta, para detecção precoce de qualquer anomalia. Após 7 dias foi realizada a primeira troca de meio de cultivo. Uma vez que se iniciou o crescimento celular ao redor dos explants, o meio de cultivo foi renovado a cada 3 dias. Quando 70% do fundo do frasco de cultura estava coberto por células (subconfluência), essa cultura primária foi sub-cultivada.

Para tanto, as garrafas confluentes passaram por tripsinização: depois de retirado todo meio de cultivo das garrafas, estas foram lavadas com solução de PBS, e adicionadas de 2 ml de Tripsina Vernese (Instituto Adolfo Lutz, 0,2% Tripsina e 0,02% Versene) à 36ºC. As garrafas foram mantidas em estufa a 38,5º C por no máximo 10 minutos, ou até que todas as células se soltassem do fundo.

Foi realizada então, a neutralização com meio DMEM acrescido de 20% de SFB e Penicilina/Estreptomicina, na proporção de 3:1 (3ml de meio para 1ml de tripsina). Uma amostra de 50 μl desta mistura células + meio foi retirada e adicionada a 50 μl do corante Tripan Blue, onde as células azuis, que permitem a passagem do corante, estavam mortas e, as células translúcidas, que não permitem passagem do corante, estavam vivas. A mistura foi então, destinada ao preenchimento da Câmara de NeuBauer para contagem das células translúcidas dos 4 quadrantes mais externos. Após isso, as células que descolaram das garrafas foram centrifugadas com meio DMEM e ressuspendidas em placas de cultura de poliestireno com 6 poços em uma concentração de 1x105 _{células por poço.}

Para o bloqueio do crescimento celular, os poços contendo células em confluência (20x104 _cels/1.9cm2 _{por poço) tiveram seu meio substituído por 4,0 ml de}

solução contento mitomicina C (10μg/ml), previamente preparada. Tal meio foi incubado por 24 horas. Em seguida, o meio foi retirado, os poços foram lavados por duas vezes com PBS e então, foi colocado meio específico para células-tronco embrionárias.

2.2. Isolamento das células tronco embrionárias

Para facilitar a remoção da zona pelúcida bem como o isolamento da MCI, uma cunha foi feita no fundo da placa pela pressão da lâmina de bisturi contra o fundo plástico da mesma. Esta cunha serviu como apoio para rompimento da zona pelúcida e remoção do trofoblasto. A massa celular interna (MCI) foi isolada por microcirurgia, com auxilio de duas agulhas de insulina sob estereomicroscópio (aumento de 10x). Após o isolamento, a MCI foi transferida para as placas contendo a monocamada de fibroblastos inativados previamente preparada.

3. Cultivo das células tronco embrionárias

Optou-se por utilizar blastocistos com 9 dias de desenvolvimento devido ao maior sucesso do cultivo das CTE em experimentos anteriores.

As CTE foram cultivadas sobre a monocamada de suporte (20x104 _céls/1.9cm2_{), em}

SFB, penicilina G sódica 10000 UI e sulfato de estreptomicina 10.000μg/ml para cada 1ml de meio, 1% de aminoácidos não essenciais, 0,1mM de 2-Mercaptoetanol, 0,1mM de Piruvato de Sódio e 1000U de Fator inibitório de leucemia (LIF) e 8ng/ml de fator de crescimento fibroblastico básico (bFGF).

O cultivo foi realizado em estufa úmida a 38.5ºC com umidade relativa próxima de 100% e atmosfera gasosa de 5% de CO2, e foi realizada a troca do meio a cada 48

horas. A taxa de crescimento e aspectos morfológicos das células foi avaliada utilizando-se o microscópio invertido com as lentes objetivas de aumento 10, 20 e 40X.

Após o cultivo inicial dos blastômeros, as colônias estabelecidas foram repicadas mecanicamente sob o estereomicroscópio. Para tanto, as colônias iniciais foram repicadas com o auxílio de pipetas de vidro estéreis sob o estereomicroscópio (aumento de 10X) em fluxo laminar. Cada colônia foi dividida em três fragmentos os quais foram adicionados a novas placas de cultivo (também previamente tratadas com monocamada de fibroblastos) na concentração de dois fragmentos por poço.