a coloração é a Grocott As imagens possuem uma magnitude de 200x As

fotomicrografias denominadas A e A1; B e B1; C e C1 representam respectivamente,

animais infectados e sacrificados com 15, 30 e 60 dias após infecção. As setas indicam o infiltrado linfocitário na região periobronquiovascular.

A A1 B B1 C C1

3.2.3-Dosagem de NO e dos anticorpos IgG1 e IgG2a

Em relação ao óxido nítrico (NO) observa-se na figura 14 que a produção deste composto para os grupos experimentais da infecção intratraqueal aumenta no decurso do tempo infecção. O grupo de animais Balb/c infectados com 106 leveduras do isolado Pb01 apresentou uma produção média de 122µ M NO2 em 15 dias e de 128µ M NO2 para

30 dias infecção. Estando estes valores acima da média do grupo de animais C57Bl/6 infectados com 105 leveduras do isolado Pb18 para estes mesmos pontos, pois com 60 dias após infecção a média deste grupo é de 137µ M NO2 ficando um pouco acima do

grupo Pb01 106 leveduras a qual foi de 133µ M NO2. Isto pode ter ocorrido devido a

menor carga fúngica pulmonar no grupo Pb01 106 em relação ao Pb18 105, como também, a diferença da linhagem dos animais experimentais usados nestes dois grupos.

Figura 14: NO liberado nos pulmões dos animais C57Bl/6 infectados

intratraquealmente. Barras hachuradas representam animais infectados com 105leveduras do isolado Pb01; Barras pretas são os inoculados 105leveduras do isolado Pb18. Experimentos realizados em triplicata, * representa a diferença estatística em relação ao tempo 15 dias, com p<0,05.

Analisou-se a presença das imunoglobulinas IgG1 e IgG2a nas amostras do soro dos animais infectados intratraquealmente (tabela 3). Para os animais infectados com 105 leveduras do isolado Pb01 observa-se que as concentrações de IgG1 são maiores até 30

dias após infecção e depois decaem. Enquanto, as concentrações de IgG2a aumentam progressivamente no período analisado. Para os animais infectados com 105 leveduras do isolado Pb18, observamos uma produção similar, porém com níveis mais elevados de IgG1.

Os animais Balb/c infectados com 106 leveduras do isolado Pb01 pela via intratraqueal apresentaram um padrão de produção de isótipos misto, ou seja, elevadas concentrações tanto de IgG1 como de IgG2a. O mesmo padrão de produção de isótipos foi observado para animais infectados com 106 leveduras do isolado Pb18 pela via endovenosa (dados não apresentados).

Tabela 3: Dosagem dos isotipos IgG1 e IgG2a no soro animais C57Bl/6 infectados pela via intratraqueal com 105 leveduras

Resultados expressos estão na diluição 10x dos soros dos animais infectados, DO = 492nm. IgG1 IgG2a Dias após infecção Pb01 105 Pb18 105 Pb01 105 Pb18 105 15 0,021 0,04 0,005 0,021 30 0,042 0,079 0,013 0,025 60 0,020 0,038 0,019 0,028

Discussão

O conceito de espécies filogenéticas, o qual detecta divergência genética entre grupos através do seqüênciamento de multi-locus representada pela concordância na genealogia de genes, é o método mais apropriado para reconhecimento de espécies de fungos (Theodoro et al., 2008). Matute (2006) demonstrou a existência de pelo menos 3 espécies filogenéticas no gênero Paracoccidioides (S1, PS2, PS3) já que era classificado taxonomicamente como espécie clonal (Morais et al.,2000). Seus resultados seguiram para tentar detectar especiação críptica por meio da concordância ou não na genealogia de genes em relação à filogenia de seqüências genes nucleares, como foi realizado para o fungo Neurospora.

O fungo P. brasiliensis apresenta isolados com diferentes características fenotípicas relacionadas ao crescimento; morfologia de micélios; produção de conídios; transição de micélio para levedura; microscopia da levedura em relação ao tamanho e a forma desta célula com os de seus brotamentos; virulência e manifestações clínicas (Theodoro et al., 2008). Variações na virulência e na expressão genética do P. brasiliensis vêm sendo demonstradas entre seus isolados que se situam nos grupos filogenéticos S1 e PS2 (Hebeler-Barbosa et al., 2003; Carvalho et al., 2005). O isolado Pb18 está incluso dentro do grupo S1, porém o isolado Pb01 está separado dos isolados que se agrupam nos 3 grupos filogenéticos S1, PS2, PS3, como exemplo de integrantes destes grupos podemos citar isolados Pb339, Pb2 e DASYPUS respectivamente (Carrero et al., 2008). Revelando uma diferença significativa entre o isolado Pb01 e os isolados dos 3 diferentes grupos genéticos, este fato corrobora com estudo (Teixeira, 2008) o qual sugere que Pb01 representa uma nova espécie no gênero Paracoccidioides. Além disso, Carrero et al., 2008 e Teixeira, 2008 classificaram este isolado junto com outros isolados como uma nova espécie filogenética – Pb01-like – para o fungo P. brasiliensis.

Estas recentes descobertas de espécies crípticas do fungo P. brasiliensis, como também, de uma nova espécie para gênero Paracoccidioides aumenta a importância de correlacionarem os isolados conhecidos por meio de marcadores moleculares para fins de diagnóstico. Esta separação genética entre os grupos pode resultar no acúmulo de algumas diferenças nas estratégias para sobrevivência no hospedeiro, como também, no meio saprobiótico (Theodoro et al., 2008). Além disso, características micológicas como morfologia e virulência são necessárias para compreender se as diferenças

genéticas e patogênicas observadas entre os isolados do gênero Paracoccidioides podem resultar em diferenças nas formas clínicas da PCM apresentadas pelo hospedeiro.

Neste trabalho, utilizaram-se as características morfológicas dos isolados Pb01 e Pb18 para auxiliar na compreensão da resposta imune induzida por estes isolados em modelo murino. Fato este inovador, já que a literatura científica aborda a virulência como principal característica fenotípica correlacionada com os aspectos imunológicos (Franco et al., 1993; Singer-Vermes et al., 1994; Mollinari-Madlum et al., 1999; Camargo et al., 2000). Observou-se que as células do isolado Pb01 possuem uma menor média nos valores do diâmetro das leveduras tanto na célula mãe, como dos seus brotamentos e com predomínio da forma circular, ao se comparar com os dados do isolado Pb18 que tiveram uma maior média nos valores do diâmetro e a forma variando de circular a elíptica. Em relação à espessura da parede celular as leveduras do Pb01 apresentaram-se mais espessas que as do Pb18.

Estes resultados podem explicar alguns pontos na capacidade dos macrófagos MH-S de fagocitarem de forma mais rápida e em maior quantidade as leveduras do Pb01 em relação ao Pb18 nos experimentos in vitro. Além disso, nos ensaios in vivo nota-se que a relação do tamanho do inóculo utilizado na infecção dos animais experimentais teve uma influência direta com aumento do processo inflamatório no pulmão, visto que o isolado Pb18 gerou a formação de granulomas no tecido pulmonar ao longo dos dias estudados. Sanchez e colaboradores (2008) estudaram as diferenças fenotípicas ligadas a morfologia e virulência em 2 espécies do gênero Cryptococcus (C. neoformans e C. gattii) e a influência destas características fenotípicas na patogenicidade dos fungos. Observaram através de microscopia diferenças morfológicas no tamanho das cápsulas entre as espécies, sendo que C. gattii possui uma cápsula maior o que influencia na forte patogenicidade quando comparado com C. neoformans (Torres-Rodríguez et al., 2003). Este fato corrobora com nossos resultados em relação ao fungo P. brasiliensis, no qual isolado com maior tamanho possui uma maior patogenicidade.

Pesquisas desenvolvidas com o fungo do gênero Cryptococcus, também abordam a virulência de diferentes isolados deste fungo como principal característica fenotípica correlacionada com os aspectos imunológicos desenvolvidos pelos hospedeiros para combater a infecção. Blackstock e colaboradores (1999) observaram uma regulação da resposta imune de forma diferencial entre um isolado virulento e outro com baixa virulência do fungo C. neoformans.

Adesão do microorganismo patogênico no tecido hospedeiro é considerado ponto crucial no processo de colonização e disseminação do parasita no organismo. Este processo de invasão induz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelos leucócitos do hospedeiro com intuído de inibi-lo. Assim, a produção de ROS gerada pela resposta imune na infecção pelo P. brasiliensis, ocasiona um estresse oxidativo na célula fúngica que induz a perda da homeostasia celular (Campos et al., 2005). Portanto, a sobrevivência de fungos patogênicos no hospedeiro depende da capacidade da célula fúngica de evadir da resposta imune do hospedeiro.

Os macrófagos são considerados peças centrais na imunidade anti-P. brasiliensis, pois eles podem conter a infecção fúngica. Porém, também podem ser utilizados pelos fungos como ambiente propício para sua multiplicação e disseminação no organismo do hospedeiro (Benarde, 2008). Observamos este fato nos experimentos in vitro com macrófagos infectados com isolado Pb18 onde possivelmente os macrófagos facilitaram a multiplicação deste isolado no meio intracelular e nos ensaios in vivo eles podem ter auxiliado na disseminação do Pb18 pelo tecido pulmonar dos animais experimentais. Mas, na relação dos macrófagos com isolado Pb01 nos ensaios in vitro ocorreu uma redução na multiplicação das leveduras no meio intracelular e nos experimentos in vivo a infecção dos animais ocasionada pelo isolado Pb01 foi contida.

Estes resultados estão em acordo com os dados de Soares e colaboradores (2001) que ao utilizarem macrófagos provenientes de pessoas saudáveis quando foram infectados com isolado virulento de P. brasiliensis (Pb18) tiveram uma limitada atividade in vitro contra o fungo, porém, nos infectados com isolado menos virulento (Pb265) não se observou esta limitação na atividade do macrófago. Tavares e colaboradores (2007) estudaram o perfil transcricional do P. brasiliensis em resposta à fagocitose por macrófagos murinos, observaram que após 6 horas de interação, o fungo induziu nos macrófagos a transcrição de genes relacionados à atividade pró-inflamatória e de fagocitose, e este apresentou a expressão de genes relacionados ao estresse oxidativo e nutricional.

A análise do trascriptoma do Paracoccidioides brasiliensis revelou que este patógeno possui diferentes vias de combate as espécies reativas de oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNI) que o hospedeiro produz, como por exemplo: catalases; superóxido dismutase; glutationa peroxidase e citocromo c peroxidase (Felipe et al., 2005). Além disso, na interação P. brasiliensis-hospedeiro, o fungo está em vantagem, pois os genes que codificam a produção de ROS pelas células imunes do hospedeiro promovem a

ativação das enzimas da via combate aos ROS no fungo. Mas, a capacidade microbicida dos macrófagos está relacionada com a produção de RNI, dentre estas espécies, o NO é o mais potente agente citotóxico (MacMicking et al., 1997) e participa da morte de P. brasiliensis (Gonzalez et al., 2000).

Óxido nítrico é sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase a partir do aminoácido L-arginina. Souto e colaboradores (2000) demonstraram que há uma relação direta entre a produção de NO pelos macrófagos e a presença das citocinas TNF-α e IFN-γ, se a concentração destas decair ocorre uma diminuição na geração de NO. Sendo que o TNF-α está associado com atividade fungicida dos macrófagos em relação ao P. brasiliensis (Calvi et al., 2003). O óxido nítrico possui um papel protetor, pois atua como molécula efetora da citotoxicidade dos macrófagos e também, pode atuar como regulador da resposta inflamatória (Gonzalez et al., 2000). Este papel do NO foi evidenciado nos ensaios in vitro dos macrófagos infectados com isolado Pb01, onde a concentração de NO teve um aumento exponencial ao longo das horas de co-cultivo ocasionando uma diminuição da viabilidade das leveduras recuperadas após interação com os macrófagos.

Bocca e colaboradores (1998 e 1999) relataram que NO possui um papel secundário que pode ocasionar a imunossupressão. Este fato corrobora com os dados de Nascimento e colaboradores (2002) que relacionam a produção persistente de NO com a susceptibilidade à infecção por P. brasiliensis. Na infecção sistêmica dos animais inoculados com isolado Pb18, observou-se uma menor capacidade linfoproliferativa em todos os tempos analisados em relação ao isolado Pb01. Entretanto, na infecção intratraqueal houve uma produção e liberação contínua de NO que foi aumentando gradativamente ao longo dos dias de infecção, podendo este fato explicar a imunossupressão observada na outra forma de infecção.

O curso da infecção ocasionada pelo P. brasiliensis depende da virulência deste fungo, como também, da resistência natural do hospedeiro à infecção. Teixeira e colaboradores (1987) infectaram animais considerados resistentes à infecção pelo P. brasiliensis (A/SN) e susceptíveis (B10.A) com isolado virulento (Pb18) e não virulento (IVIC Pb267) e observaram um rápido estado de imunossupressão nos animais susceptíveis infectados com Pb18 e nos inoculados com IVIC Pb267 não houve esta rápida imunossupressão, que somente começou a surgir após 12 semanas de infecção. Observou-se estes mesmos acontecimentos nos experimentos de capacidade linfoproliferativa dos animais com infecção sistêmica, sendo que camundongos

inoculados com Pb01 apresentaram até 4 semanas após infecção uma maior capacidade linfoproliferativa, mais posteriormente esta capacidade decaiu tornando-se similar com a do Pb18.

Benarde (2008) observou que o déficit na resposta linfoproliferativa aos mitógenos, como também, aos antígenos de P. brasiliensis pode ser ocasionado pela deficiência na imunidade celular dos pacientes com PCM, pois a falta de um adequado sinal co-estimulatório pode ocasionar anergia das células T nestes indivíduos.

Zacharias e colaboradores (1986) realizaram um estudo comparativo da histopatologia e da imunologia em animais infectados endovenosamente com 3 tipos de isolados de P. brasiliensis (Pb18, Pb192 e Pb265, que apresentam diferenças em relação à virulência). Seus resultados demonstraram que o isolado Pb265 não induziu a formação de granuloma no pulmão e nem a produção de anticorpos, além disso, a imunidade celular foi significantemente baixa quando comparada com os outros dois isolados. Os granulomas induzidos pelo Pb18 e também, pelo Pb192 apresentaram-se ricos em fungos, mas com diferenças entre si nas quantidades de células mononucleares. Porém estes isolados tiveram similaridades nas respostas imunes humoral e celular contra P. brasiliensis. Devido a estes fatos, os autores consideraram isolado Pb265 não virulento e os outros dois isolados virulentos (Zacharias et al., 1986).

Na análise histopatológica do pulmão tanto na infecção sistêmica como na infecção intratraqueal nos animais inoculados com o isolado Pb18, houve uma resposta inflamatória progressiva na formação de granulomas no tecido pulmonar com decurso do tempo infecção. Porém, os animais inoculados com Pb01 nas duas formas de infecção não houve a formação de granulomas, somente a presença de infiltrados inflamatórios localizados próximos da região periobronquiovascular, os quais foram tornando-se mais densos e intensos ao longo tempo infecção. Estes dados corroboram com os resultados obtidos na recuperação das CFU/g pulmão nos dois tipos de infecção para ambos isolados, sendo que o grupo Pb18 houve um aumento progressivo no decurso da infecção sistêmica e da intratraqueal nas quantidades de colônias recuperadas. Mas, para isolado Pb01 ocorreu uma diminuição na quantidade CFU/g pulmão recuperada no decorrer da infecção sistêmica. Na infecção intratraqueal do grupo Pb01 foi necessário aumentar concentração do inóculo de infecção 10 vezes em relação ao do grupo Pb18 para conseguir recuperar as CFU/g pulmão. Após 15 dias de infecção não se conseguiu recuperar as colônias, 30 dias foi o ponto com a maior

quantidade de CFU recuperada para este grupo e aos 60 dias houve um decréscimo na quantidade de CFU recuperada do tecido pulmonar.

Uenotsuchi e colaboradores (2006) observaram que as diferenças na virulência das linhagens do fungo Sporothrix schenckii e no estado imune do hospedeiro podem contribuir com as diferentes formas de manifestações clínicas desta micose. Investigaram a interação entre monócitos derivados das células dendríticas com 2 duas linhagens (uma de origem visceral e outra cutânea) deste fungo. Observaram que a linhagem cutânea induziu uma forte resposta Th1 com uma alta ativação dos monócitos, enquanto a visceral induziu uma mínima ativação dos monócitos, como também, uma fraca resposta Th1 (Uenotsuchi et al., 2006).

As células Th1 secretam citocinas que ativam os macrófagos. Além disso, a produção de citocinas por estas células possui um papel na regulação da expressão do tipo de imunoglobulina. A secreção de IFNγ por estas células participa na indução da expressão do tipo IgG2a em murinos (Kun et al., 2001). Observou-se na infecção sistêmica dos animais inoculados com isolado Pb01 uma resposta imunológica com uma tendência a resposta de padrão Th1, e na infecção intratraqueal houve uma resposta imunológica de padrão misto (Th1 e Th2). Mas, nos dois tipos de infecção os animais inoculados com Pb18 houve uma tendência em relação à resposta Th2.

As diferenças morfológicas e patogênicas observadas entre isolado Pb01 e Pb18 podem ser possivelmente devido às diferenças na expressão gênica de cada isolado estudado. Já que o isolado Pb01 apresenta 32,94Mb de comprimento da sequência completa do genoma e o número de genes deste genoma que predizem códigos para a síntese de proteínas é entorno de 9,132. O isolado Pb18 apresenta um menor comprimento da sequência completa do genoma (29,95Mb), como também, uma menor quantidade de genes (8,741) que predizem códigos para a síntese de proteínas (http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/GenomeSt ats.html).

Diferentes apresentações clínicas da PCM podem ser ocasionadas pela virulência dos isolados de P. brasiliensis no qual hospedeiro foi infectado. Estudos sobre a biologia do fungo estão começando a direcionar quais mecanismos e moléculas existentes entre os diferentes isolados de P. brasiliensis podem estar associadas com a virulência e a patogenicidade de cada tipo de isolado, como também, podem ajudar a elucidar os mecanismos de susceptibilidade e de resistência apresentados pelos modelos animais em determinados tipos infecção induzida por diferentes isolados.

O desenvolvimento de novas drogas antifúngicas está buscando utilizar as pesquisas moleculares sobre a composição da parede celular dos diferentes isolados fúngicos, com intuíto de construir drogas antifúngicas altamente específicas. Desta forma, a utilização do método do diagnóstico molecular para investigar o tipo de isolado fúngico que o paciente com PCM foi infectado, facilitará a prescrição do melhor e mais específico medicamento antifúngico. Assim, o conhecimento sobre a morfologia, patogenia e genética de cada isolado do gênero Paracoccidioides possivelmente poderá auxiliar no diagnóstico, como também, no tratamento dos pacientes com PCM. Portanto, uma das possíveis perspectivas que este trabalho pode deixar, é a realização de um estudo sobre a composição da parede celular do isolado Pb01 para verificar a presença e quantidade de α-1,3-glucana e de α-manana comparando com dados relativos de outros isolado, pois estes componentes se relacionam com o grau de virulência e o poder patogênico de um isolado. Além disso, utilizar uma linhagem mais susceptível a PCM, ou seja, a linhagem B10.A como modelo experimental de PCM induzida pelo isolado Pb01 comparando-se com a PCM induzida por um outro isolado do grupo filogenético Pb01-like.

Conclusão

O isolado Pb01 apresenta um menor tamanho e uma parede celular mais espessa em relação ao isolado Pb18. Estes fatores influenciaram na interação do isolado Pb01 com os macrófagos (MH-S), que fagocitaram de forma mais rápida e em maior quantidade as leveduras Pb01, como também, induziu uma maior produção de NO pelos macrófagos quando comparado com isolado Pb18. O isolado Pb01 induziu nos animais experimentais utilizados neste trabalho uma resposta imunológica mais efetiva, possivelmente devido a sua característica de ser mais imunogênico do que Pb18. Desta maneira, o isolado Pb01 possui uma menor patogenicidade em relação ao isolado Pb18. Estes dados sobre o isolado Pb01 corroboram com as pesquisas sobre a nova espécie críptica a Pb01-like para espécie Paracoccidioides brasiliensis.

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