Para os experimentos com CO2 e a adição de co-solventes (CO2 + etanol e CO2 +
acetato de etila), o CO2 foi bombeado até o extrator, previamente alimentado com etanol
(130 mL) ou acetato de etila (130 mL) e mantido nas mesmas condições de pressão e temperatura do vaso extrator. Em seguida, o dióxido de carbono supercrítico saturado com um dos co-solventes foi conduzido ao vaso no qual se encontrava o material vegetal.
Amostras foram coletadas após a passagem de 50 L de CO2 pelo extrator. Após a retirada
de cada amostra, o extrator foi aberto e o volume do co-solvente completado para 130 mL, de maneira que a composição do solvente alimentado na coluna se mantivesse constante durante todo o processo.
A solução de extrato foi preparada e a massa quantificada como descrito anteriormente.
3.3.3 - Extração com CO2 puro – avaliação dos parâmetros de processo
Para a avaliação da influência das variáveis de processo (pressão, temperatura, vazão e diâmetro de partícula) sobre o rendimento global de extrato e rendimento de espilantol, ensaios de extração utilizando CO2 supercrítico foram realizados na faixa de
temperatura de 40 a 60 ºC e pressões entre 76 e 352 bar. O extrator foi preparado utilizando em cada uma das extremidades uma tela de inox para evitar arraste de material e esferas de vidro com a finalidade de completar o leito. Na realização destes ensaios, aproximadamente 12 ± 0,5 g de material vegetal foram alimentados ao extrator. O solvente foi bombeado lentamente para o extrator, a fim de prevenir o arraste do soluto. Atingidas as condições de operação, as extrações foram realizadas através do método dinâmico com fluxo contínuo. Vazões de 1,0 e 2,0 L/min de gás expandido (CNTP) foram inicialmente avaliadas. Amostras foram coletadas após a passagem de 45 ou 90 g no início da extração e a cada 180 g de CO2 na fase final, de acordo com o experimento. Cada ponto experimental
representa a média de 2 ou 3 experimentos independentes. As amostras de extrato foram coletadas por precipitação do material ao despressurizar a mistura através de uma válvula micrométrica e através da lavagem da linha de saída da válvula micrométrica com etanol. O extrato precipitado foi coletado em frasco de vidro (kitassato) imerso em banho de gelo. Etanol foi adicionado no frasco separador para aumentar a recuperação do extrato. A massa de CO2 foi determinada através do medidor totalizador de fluxo mássico. A solução de
extrato obtida foi transferida para um balão volumétrico de 100 mL. Uma alíquota de 0,5 mL foi retirada para análise por CLAE, de acordo com a metodologia descrita na Seção 3.4.3 e a solução restante foi concentrada até a evaporação completa do solvente em um sistema de rotaevaporação (Heildoph Instruments, Alemanha) para quantificação da massa de extrato. A massa de extrato obtida foi corrigida considerando a alíquota retirada.
Em todos os ensaios realizados neste trabalho, após o final do experimento o sistema foi lavado com etanol quente até que a solução de lavagem saísse incolor. Antes que um novo experimento fosse iniciado, o equipamento era seco utilizando ar comprimido e dióxido de carbono pressurizado.
3.4 - Métodos analíticos
Nesta seção são apresentados os métodos analíticos empregados na identificação e determinação das concentrações de espilantol nos extratos, bem como os métodos utilizados na identificação da composição química dos mesmos. A caracterização das frações obtidas foi realizada através de cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia gasosa e espectrometria de massa (CG-MS) e por ressonância magnética nuclear de 1H e 13C (RMN), de acordo com a necessidade e especificidade da amostra. As análises de CCD e RMN foram realizadas no DQO/IQ/UFBA e as análises de CLAE e CG-MS foram realizadas no laboratório de Tecnologia Química da empresa Natura Cosméticos S.A.
3.4.1 - Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
A análise por cromatografia em camada delgada (CCD) foi utilizada para verificar de forma rápida a presença de espilantol nas amostras. A análise de CCD foi realizada em cromatoplacas de sílica gel 60 F254 (Merck). A fase móvel foi composta de hexano: acetato de etila na proporção 1:1. Este sistema de eluição foi o que apresentou melhor resolução dentre vários testados. As placas foram reveladas utilizando irradiações em luz ultravioleta (UV) no comprimento de onda de 254 nm e vapores de iodo. Os extratos eram aplicados juntamente com uma alíquota de uma solução contendo o padrão de interesse para comparação.
3.4.2 - Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os espectros de RMN de 1H e 13C foram registrados em um espectrômetro Gemini 2000 (Varian Associates, E.U.A) operando com freqüências do hidrogênio a 300 MHz e do carbono a 75 MHz. O solvente utilizado para dissolução das amostras e obtenção dos
espectros de RMN foi clorofórmio deuterado (CDCl3). Esta análise foi realizada na
caracterização inicial das amostras de extratos obtidas a diferentes condições.
Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e foram referenciados pelo pico pertencente à fração não deuterada do clorofórmio para RMN de 1H (7,27 ppm) e para RMN de 13 C (77,0 ppm).
As multiplicidades das absorções foram indicadas segundo a convenção: s (simpleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), t (tripleto), dt (duplo tripleto).
3.4.3 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A análise por cromatografia líquida de alta eficiência foi realizada utilizando um cromatográfo Alliance com detector PDA 2996 (Waters, E.U.A), coluna X-terra RP18 (4,6 x 250 mm, 5µm), fase móvel composta por acetonitrila e água na proporção 70:30 com vazão de 1 mL/min. Uma alíquota de 0,5 mL da solução de extrato previamente preparada foi filtrada em filtros de 0,22 µm. Parte da solução filtrada (20 µL) foi injetada no cromatógrafo para quantificação da concentração (µg/mL) de espilantol na amostra através de uma curva analítica previamente construída com o padrão de espilantol. A curva analítica relaciona a área integrada do pico referente ao espilantol puro com a concentração da solução padrão. A curva analítica e o cromatograma para o padrão de espilantol são apresentados no Anexo A.
3.4.4 - Cromatografia Gasosa - Espectrometria de massas (CG-EM)
Os espectros de massas foram obtidos através de ionização por elétrons (IE) a 70 eV em espectrômetro Shimadzu , modelo QP-2010, com detector seletivo de massas (MSD) quadrupolo, equipado com coluna Capilar Rxi-5MS, com 30 m de comprimento, 0,25mm de diâmetro interno e 0,25um de espessura de filme. A temperatura do injetor foi mantida a 220 °C e a programação do forno de 60 a 250 °C, com taxa de aquecimento 3 °C/min. A identificação dos componentes foi realizada através da comparação dos espectros de massa com os padrões contidos no banco de dados da biblioteca de espectros, “NIST Mass Spectral Library”.