As análises de citogenética molecular (FISH) nos 55 doentes com cariótipo normal não revelaram a presença de anomalias citogenéticas (tabelas 10 e 11).
Os resultados da técnica de FISH nos 6 doentes com cariótipo anormal, com anomalias detectáveis pelo painel de sondas de FISH utilizado, confirmaram as anomalias observadas no cariótipo. Num dos doentes com cariótipo anormal observou-se discrepância dos resultados de citogenética convencional e molecular, tendo sido observada na análise de FISH uma anomalia adicional, nomeadamente trissomia 8, não detectada no cariótipo (tabelas 10 e 11). A pesquisa por FISH de anomalias nos doentes com cariótipo anormal, com anomalias indetectáveis pelo painel de sondas utilizado, não revelou a presença de anomalias adicionais (tabelas 10 e 11).
Nos 7 doentes sem resultado de citogenética convencional por insucesso da cultura celular o resultado da técnica de FISH foi normal.
Tabela 11 - Comparação dos resultados da citogenética convencional e FISH
Citogenética molecular (FISH) Normal Anormal Cit o g e n é tic a c o n v e n c io n a l (c a rió tip o ) Normal 55* 0*
Anormal /Anomalias detectáveisa 7** 8**
Anormal/Anomalias indetectáveisa 3** 0**
a
Anomalias citogenéticas detectáveis/indetectáveis pelo painel de sondas de FISH utilizado(-5/5q-, -7/7q-, +8, 20q-) * nº de casos **nº de anomalias
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1. Considerações metodológicas
Os estudos de citogenética convencional identificam clones de anomalias cromossómicas nas amostras de medula óssea da maioria dos doentes com doenças hematológicas. Contudo, um resultado citogenético normal pode ser obtido por múltiplas razões, tais como dificuldade em obter aspirados medulares adequados, preparações de má qualidade devido a um aspirado medular limitado, dificuldades técnicas durante o processamento das amostras, enviesamento na análise das metafases, erro de amostragem, mutações crípticas/submicroscópicas, falta de células neoplásicas em divisão ou um cariótipo verdadeiramente normal (Ketterling et al., 2002; Naeim et al., 2008). A falta de células neoplásicas, devida à eventual incapacidade de divisão apropriada in vitro do clone displásico, dificulta a detecção de anomalias cromossómicas pelas análises de citogenética de rotina de 20-25 metafases. Geralmente, o cariótipo é insuficiente para detectar uma linha celular representada por menos de 5% de células anormais, se forem analisadas menos de 50 metafases. Importa ter em conta que a análise detalhada de 50 metafases nas neoplasias hematológicas é raramente possível (Skonieczka et al., 2009). As análises citogenéticas estão, nestes casos, limitadas a outras células não-neoplásicas ou não são exequíveis devido à completa falta de células em divisão (Ketterling et al., 2002; Bernasconi et al., 2003).
Contrariamente à citogenética convencional, as análises de hibridação in situ com fluorescência não dependem de células em divisão e podem ser realizadas em núcleos interfásicos. Esta potencialidade permite não só analisar um elevado número de células, mas também identificar pequenos clones de células anormais não detectáveis por citogenética convencional, os quais podem ter um papel importante na progressão da doença. Além disso, a análise de FISH é também uma técnica adequada para detectar anomalias submicroscópicas, especialmente deleções, indetectáveis por citogenética convencional (Rigolin et al., 2001; Bernasconi et al., 2003). Na maioria dos casos com deleções crípticas o estudo de FISH em metafases mostrou que o tamanho das deleções se encontrava abaixo do poder de resolução da análise citogenética convencional. Alguns casos de neoplasias mielóides com cariótipos aparentemente normais, quando analisados por FISH, mostraram a presença de um clone minor com deleções submicroscópicas (Rigolin et al., 2001). Outra vantagem dos estudos de FISH consiste na combinação desta técnica com técnicas de citologia e/ou imunohistoquímica na avaliação do padrão citogenético de populações celulares específicas, no sentido de monitorizar os efeitos da terapia e detectar doença residual mínima (Naeim et al., 2008).
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A técnica de FISH apresenta, no entanto, algumas limitações. A FISH avalia alterações específicas, com base numa selecção de sondas, em vez do conjunto completo de cromossomas, possibilitando apenas a identificação de alterações marcadas por sondas moleculares rigorosamente definidas, complementares às estruturas do genoma seleccionadas (Skonieczka et al., 2009). As sondas disponíveis para a prática clínica não permitem avaliar todas as anomalias recorrentes de interesse e a variabilidade nas anomalias citogenéticas (com rearranjos complexos ou diferenças nos pontos de quebra) podem não ser detectadas pelas sondas convencionais (Olney e Le Beau, 2009).
2. Diagnóstico citogenético das síndromes mielodisplásicas - padrão de
anomalias cromossómicas obtido por citogenética convencional e
molecular
Actualmente, a relevância biológica e clínica da análise citogenética na caracterização das SMD é indubitável. Nos doentes com SMD as anomalias cromossómicas permitem não só confirmar a clonalidade da doença, mas também estratificar os doentes em subgrupos de prognóstico. Além disso, a abordagem citogenética sequencial da medula óssea do doente em diferentes estádios da doença pode fornecer informações sobre a eficácia do tratamento, através da monitorização do tamanho do clone neoplásico (Rigolin et al., 2001; Bernasconi et al., 2003; Skonieczka et al., 2009).
A determinação do padrão de anomalias citogenéticas numa série de doentes com diagnóstico de síndrome mielodisplásica constituiu um dos objectivos deste estudo. O grupo de doentes estudado apresentava uma idade média ao diagnóstico inferior ao descrito na literatura (64,3 anos vs. 76 anos). A maior predominância de doentes do sexo masculino (M:F=56:46) está de acordo com os dados epidemiológicos publicados que referem uma incidência de SMD mais elevada nos homens.
As anomalias citogenéticas detectadas neste estudo estão em concordância com as anomalias cromossómicas recorrentes observadas nos doentes com SMD. A anomalia mais frequente foi a deleção 5q-, o que está de acordo com o descrito na literatura, no entanto a frequência obtida foi inferior à observada noutros estudos (6,9% vs. 10-20%) (Olney e Le Beau, 2002; Haase, 2008). À semelhança de outros estudos publicados as anomalias do cromossoma 7 foram as segundas alterações cromossómicas mais observadas. As outras anomalias cromossómicas isoladas observadas neste estudo
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foram trissomia 8, ausência do cromossoma Y, rearranjo do cromossoma 3, deleção 11q23 e rearranjo do cromossoma 2. A frequência destas anomalias foi inferior à relatada noutros estudos. Em 3 doentes foram observados cariótipos complexos com diversas anomalias estruturais e numéricas.
Globalmente, neste estudo a citogenética convencional detectou anomalias cromossómicas numa percentagem inferior à descrita na literatura (14,7% vs. 30-50%) (Naeim et al., 2008). Importa realçar que a frequência de anomalias citogenéticas nos doentes com diagnóstico definitivo de SMD foi de 25%, enquanto a frequência de anomalias nos casos com diagnóstico provisório foi de apenas 10,5%. Este facto sugere que em alguns dos doentes com diagnóstico provisório, a suspeita de SMD poderá não ter sido confirmada, o que terá contribuído para a baixa frequência de alterações citogenéticas obtida. Um dado que reforça esta possibilidade é o facto de 36% dos doentes com diagnóstico provisório terem idade inferior a 65 anos. De acordo com um estudo publicado recentemente por Buckstein et al., cujo objectivo foi avaliar a prevalência de SMD em doentes com citopenias de etiologia desconhecida, a prevalência destas patologias é superior nos doentes com mais de 65 anos.
No presente estudo a frequência de doentes sem resultado do cariótipo por insucesso da cultura celular foi de 14,7%. Esta percentagem é semelhante à obtida noutros estudos de citogenética convencional em SMD, tais como no estudo realizado por Romeo et al., no qual a frequência de casos com insucesso da cultura celular foi de 15%.
No diagnóstico, 30-50% dos doentes com SMD apresentam cariótipo normal quando estudados por citogenética convencional. Contudo, estes doentes constituem um grupo heterogéneo do ponto de vista biológico e a sua evolução é muitas vezes imprevisível (Naeim et al., 2008). O estudo realizado por Rigolin et al. mostrou que apenas 28,7% dos doentes analisados com cariótipo normal preenchiam os critérios para a atribuição do grupo de baixo risco pelo IPSS, enquanto a maioria dos doentes foram classificados no grupo de risco intermédio-1 ou intermédio-2 (Rigolin et al., 2001).
Nas SMD, a presença de um cariótipo normal é um factor de melhor prognóstico relativamente à presença de qualquer alteração numérica ou estrutural. Deste modo, a ausência de anomalias na análise citogenética clássica pode resultar num atraso na terapia citostática ou numa terapia menos agressiva. Contudo, a falta de anomalias no cariótipo nem sempre significa que estas estão ausentes. Assim, é importante definir indicadores biológicos que permitam uma melhor caracterização dos doentes com
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cariótipo normal e que possibilitem a identificação dos doentes com SMD com cariótipo normal em risco elevado de progressão para LMA.
A identificação por FISH de anomalias típicas das SMD pode ajudar à confirmação do diagnóstico clínico.
De acordo com Rigolin et al., um resultado de FISH positivo associa-se a uma percentagem mais elevada de blastos na medula óssea, a um subgrupo de SMD de risco elevado e a uma categoria do IPSS de risco elevado. Assim, os doentes com SMD com resultado de FISH positivo apresentam um risco mais elevado de progressão para LMA comparativamente aos doentes cujos resultados de FISH são negativos. No global, os resultados obtidos por estes autores mostram que a análise de FISH pode ser útil na investigação dos doentes com SMD no diagnóstico quando é observado um cariótipo normal (Rigolin et al., 2001).
Neste estudo a análise de FISH não identificou anomalias cromossómicas em nenhum dos casos com carótipo normal ou sem resultado por insucesso da cultura celular, tendo esta técnica detectado anomalias apenas em doentes com cariótipo anormal. O painel de sondas de FISH utilizado permitiu detectar anomalias em 8,3% dos doentes. A anomalia mais frequentemente observada por FISH foi a deleção do braço longo do cromossoma 5. As outras anomalias detectadas por FISH foram monossomia 7, deleção do braço longo do cromossoma 7 e trissomia 8. A eventual presença, neste estudo, de doentes com suspeita de SMD não confirmada constitui a explicação mais provável para a baixa frequência de anomalias detectadas por esta técnica.
3. Potencial contributo da citogenética molecular (FISH) no estudo das
síndromes mielodisplásicas
De acordo com Bernasconi et al. as anomalias ocultas ocorrem em cerca 15% dos doentes com SMD com cariótipo normal, e são clinicamente relevantes dado que permitem identificar uma fracção de doentes com cariótipo normal com evolução clínica desfavorável.
Estudos iniciais de FISH mostraram que alguns casos de SMD com cariótipo normal ou com anomalias clonais, à excepção de trissomia 8 e monossomia 7, tinham trissomia 8 e/ou monossomia 7 ocultas (Cherry et al., 2003). Contudo, estudos desenvolvidos por outros autores concluíram que a taxa de detecção da monossomia 7 oculta por métodos de citogenética convencional e FISH em células interfásicas era
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semelhante e que a monossomia 7 oculta é menos comum do que o sugerido inicialmente. Além disso, de acordo com estes estudos, a monossomia 7 oculta não comporta o mesmo peso prognóstico da monossomia 7 diagnosticada em metafases (Cherry et al., 2003).
Os diferentes estudos realizados com o objectivo de avaliar a capacidade da técnica de FISH para detectar anomalias ocultas, em doentes com SMD com cariótipo normal, têm demonstrado benefícios adicionais variáveis. Alguns estudos têm demonstrado que a citogenética convencional e molecular (FISH) detectam anomalias cromossómicas nos doentes com SMD/LMA com uma frequência semelhante, e concluem que a citogenética convencional é uma excelente técnica para identificar a maioria das anomalias cromossómicas comuns, enquanto a FISH em células interfásicas ou metafásicas tem uma utilidade limitada. Pelo contrário, outros estudos demonstraram que a FISH tem a potencialidade de identificar clones minor de populações celulares num número significativo de doentes com cariótipo normal (Bernasconi et al., 2003).
No estudo realizado por Skonieczka et al. a técnica de FISH permitiu detectar alterações cromossómicas (deleção 5q31, deleção 17p13 e monossomia 7) ausentes por citogenética convencional em 30,3% dos doentes. Este estudo permitiu concluir que as técnicas de citogenética convencional e a FISH, com um painel de sondas específicas para as anomalias com significado prognóstico nas SMD, devem ser usadas simultaneamente no estudo genético das SMD, de modo a melhorar a eficácia do diagnóstico, permitir uma melhor categorização dos doentes de acordo com o prognóstico, bem como uma melhor selecção da terapia. Rigolin et al. analisaram por FISH 101 doentes com SMD com cariótipo normal, recorrendo a um painel de sondas moleculares específicas para as anomalias dos cromossomas 5, 7, 8 e 17. Estes autores encontraram alterações em 17,8% dos doentes. As anomalias detectadas por FISH foram mais frequentes nos doentes com percentagem de blastos na medula óssea mais elevada. Estas anomalias detectadas apenas por FISH estavam também associadas a uma taxa de progressão para LMA mais elevada, e consequentemente a um pior prognóstico. Assim, neste estudo a detecção de anomalias por FISH permitiu identificar um grupo de doentes com cariótipo normal caracterizados por um prognóstico inferior. Romeo et al. analisaram 40 doentes com SMD por citogenética convencional e FISH com um painel de sondas específicas para as anomalias -5/5q-, -7, +8, rearranjos 11q23 e -Y. A análise dos resultados permitiu identificar 4 doentes com anomalias ocultas observadas apenas por FISH. Panani e Pappa estudaram a incidência de trissomia 8 nos doentes com SMD primárias utilizando técnicas de citogenética convencional e FISH, tendo detectado por FISH a presença de trissomia 8 oculta, não detectada no cariótipo, em 10%
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dos casos. Bernasconi et al. detectaram anomalias citogenéticas por FISH em 15,8% dos doentes com cariótipo normal estudados. Neste estudo, os autores analisaram a sobrevida, mortalidade e taxa de progressão para LMA dos doentes, tendo demonstrado que os doentes com padrões de anomalias citogenéticas anormais detectados por FISH apresentavam uma sobrevida global e sobrevida livre de recaída inferiores, comparativamente aos doentes com resultados de FISH normais. As taxas de mortalidade e progressão para LMA foram também superiores nos doentes com resultados de FISH anormais.
Por outro lado, Ketterling et al. analisaram 32 doentes com SMD primária com cariótipo normal usando sondas de FISH para detectar as anomalias −5/5q−, −7/7q−, 17p−, +8, 12p−, 13q−, 20q−, +21 e 11q−/+11/t(11;?). Apenas num doente foi encontrada uma anomalia oculta (13q-). O estudo de Cherry et al. concluiu que a técnica de FISH em células interfásicas é aproximadamente tão sensível como a análise citogenética convencional, podendo esta técnica de citogenética molecular ser uma ferramenta útil de estudo apenas quando a análise cromossómica não é possível. Mallo et al. realizaram um estudo com o objectivo de detectar pela técnica de FISH a presença da deleção 5q- em casos sem evidência desta anomalia por cariótipo, tendo observado a presença da referida deleção apenas em casos com cariótipo anormal com o cromossoma 5 envolvido, e em casos sem metafases ou com cromossomas de má qualidade morfológica. Pinheiro e Chauffaille realizaram um estudo prospectivo de FISH em células interfásicas de doentes com SMD, tendo obtido apenas um ligeiro benefício da FISH comparativamente às técnicas de citogenética convencional.
A avaliação das vantagens e desvantagens do cariótipo e FISH na detecção das anomalias -5/5q-, -7/7q-, +8, 20q- em 102 doentes com diagnóstico, provisório ou definitivo, de SMD, bem como do contributo da técnica de FISH na detecção de anomalias ocultas, constituíram objectivos deste estudo.
Os resultados do presente estudo estão em concordância com os resultados obtidos por Ketterling et al. e Cherry et al., ou seja, um resultado normal da análise cromossómica está associado a um resultado normal por FISH. Nos 72 doentes com resultado de citogenética convencional (normal e anormal) estudados também por FISH, apenas um doente com cariótipo anormal apresentou uma anomalia detectada apenas por FISH. O doente #80 (tabela 10) constituiu o único caso no qual foi identificada por FISH uma anomalia oculta (trissomia 8 em 28% das células). O facto de esta anomalia ter sido detectada numa percentagem de células inferior à das outras anomalias observadas
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(5q- e 7q-) sugere que se trata de um clone minoritário. Dado que apenas foi possível analisar 14 metafases, o clone com trissomia 8 poderia, muito provavelmente, estar abaixo do limiar de detecção da citogenética convencional, constituindo este facto a explicação mais provável para a não detecção desta anomalia no cariótipo. Outra explicação possível para este achado reside na má qualidade das metafases obtidas, o que poderá ter dificultado a identificação da referida anomalia. Importa realçar que este achado não teve qualquer relevância clínica, dado que o doente seria, independentemente do resultado de FISH, incluído na categoria citogenética de risco elevado, devido à presença no cariótipo da deleção 7q-.
Todos os doentes com resultado de citogenética normal tiveram resultados de citogenética molecular também normais, e nos doentes com anomalias no cariótipo detectáveis pelo painel de sondas de FISH utilizado os resultados do estudo de FISH confirmaram as anomalias obtidas por citogenética convencional. De um modo geral, no presente estudo a técnica de FISH não melhorou significativamente a resolução do diagnóstico citogenético convencional.
De acordo com Rigolin et al. os doentes com SMD de risco elevado têm maior probabilidade de apresentar um clone anormal detectado apenas por FISH em células interfásicas do que os que têm SMD de risco baixo. Os resultados de um estudo recente realizado por Yang et al. demonstraram que os estudos de FISH são apenas informativos nos casos de SMD com insucesso da cultura celular e nos casos de SMD com cariótipo normal de risco intermédio ou elevado, tendo uma utilidade limitada nos casos com cariótipo normal e características morfológicas de SMD de baixo risco ou em casos com cariótipo anormal.
Atendendo aos resultados dos estudos de Rigolin et al. e Yang et al., outra explicação plausível para a baixa frequência de anomalias cromossómicas obtida neste estudo consiste no facto de a maior parte dos doentes incluídos poderem, eventualmente, ter subtipos de SMD de risco baixo. Por outro lado, contrariamente ao observado no estudo de Yang et al., no presente estudo a técnica de citogenética molecular não detectou a presença de anomalias cromossómicas nos casos com insucesso da cultura celular. Este resultado deve-se, muito provavelmente, ao reduzido número de casos sem crescimento celular analisados por FISH associado à baixa frequência de anomalias cromossómicas observada.
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Os resultados deste estudo indicam, na série de doentes estudados, que a sensibilidade da citogenética convencional e FISH na detecção de anomalias cromossómicas clinicamente relevantes entre os doentes com SMD é semelhante.
As técnicas de citogenética utilizadas no estudo das SMD apresentam vantagens e limitações, sendo a combinação das técnicas a estratégia que conduz a um diagnóstico mais preciso.
Dado que a quase totalidade das anomalias cromossómicas observadas neste estudo foi detectada por citogenética convencional, os resultados obtidos demonstram que esta técnica tem uma importância crucial na detecção da vasta maioria das anomalias cromossómicas recorrentes, pelo que este método deve continuar a ser parte integrante dos procedimentos de diagnóstico genético das SMD. Embora apresentem diversas potencialidades, as técnicas de citogenética molecular são, comparativamente à citogenética convencional, métodos mais dispendiosos pelo que devem ser utilizados apenas quando o resultado da citogenética convencional é inconclusivo ou em casos de insucesso da cultura.
Assim, a melhor estratégia de estudo genético dos doentes com SMD, visando a optimização da relação custo/benefício, consiste na aplicação sequencial das técnicas de citogenética convencional e molecular, devendo estas ser encaradas como complementares na caracterização genética das síndromes mielodisplásicas.
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