CONCENTRAÇÕES
Com o objetivo de avaliar o efeito dos tratamentos com ORL ou CDDP sobre a expressão de VEGFA total e de suas isoformas entre as células provenientes de tumor primário de CEC de língua (SCC-9) e a linhagem metastática dela descendente (LN-1), os resultados obtidos com as reações de RT-PCR foram comparados. O efeito de cada
Gráfico 6 - Análise de RT-PCR quantitativo para verificação da expressão relativa de mRNAs para VEGFA121 nas linhagens celulares SCC-9 (A e B) e LN-1 (C e D) após exposição ao
ORL ou CDDP em diferentes concentrações por 48 horas. As células SCC-9 e LN-1 apresentaram aumento estatisticamente significante da expressão deste gene quando submetidas ao tratamento com ORL, com excessão da SCC-9 incubada com a concentração 0.25 x a IC50 e da LN1 incubada com a concentração referente a própria IC50. O tratamento com CDDP não alterou significativamente a expressão de VEGFA121 nas células SCC-9, por outro lado, nas células LN-1 houve um aumento estatisticamente significante com 0,25 e 1 x a IC50 (*p<0.01, **p<0.001, ***p<0.0001; Teste Anova e Tukey; Barras de Erros representam o desvio padrão da triplicata experimental).
concentração da droga foi analisado isoladamente utilizando-se as porcentagens de expressão de cada concentração com relação aos seus respectivos controles. De forma geral, o tratamento com inibidor de FASN ORL aumentou a expressão de VEGFA total e suas isoformas nas duas linhagens celulares, sendo, de maneira geral, a SCC-9 mais sensível do que a LN-1. Por outro lado, a expressão de VEGFA total e de suas isoformas não sofreu grandes alterações entre as duas linhagens celulares após tratamento com CDDP.
Quando tratadas com ORL, a expressão de VEGFA total foi bastante superior nas células SCC-9 do que nas LN-1, apresentando significância estatística em todas as concentrações da droga aqui testadas. Sob exposição às concentrações de 0,25 e 0,5 x a IC50, a SCC-9 expressou 2 vezes mais VEGFA total do que a LN-1, enquanto que na IC50 esta diferença foi de 5 vezes (Gráfico 7 A). A expressão da isoforma VEGFA165 foi superior nas
células SCC-9 com relação à LN-1 nas concentrações 0,5 e 1 x a IC50, e menor na concentração referente a 0,25 x a IC50, apresentando significância estatística em 0,25 e 0,5 x (Gráfico 8 A). A expressão de transcritos para a isoforma VEGFA165b, analisada após a
realização de 2 experimentos com as células SCC-9 e 3 experimentos com as células LN-1, foi estatisticamente superior nas células SCC-9 com ORL em todas as concentrações estudadas, sendo que nas concentrações 0,5 e 1 x a a IC50, foi 2 vezes superior (Gráfico 9 A). Situação semelhante à do VEGFA total pôde ser observada com a isoforma VEGFA189, na
qual a expressão na SCC-9 foi estatisticamente superior do que na LN-1, sob todas as concentrações, principalmente na concentração referente à IC50, que foi cerca de 2 vezes maior (Gráfico 10 A). Este resultado assemelha-se à do VEGFA total provavelmente porque a isoforma VEGFA189 foi a mais expressa dentre as demais isoformas. Por fim, também foi
observado que a linhagem SCC-9, com relação à LN-1, apresenta expressão estatisticamente maior de VEGFA121 quando tratada com ORL nas concentrações 0,5 x e 1 x a IC50, sendo 2
vezes maior na última. Na concentração referente a 0,25 x a IC50 de ORL, não houve diferença na produção de mRNAs para VEGFA121 entre as duas linhagens (Gráfico 11 A).
Estes resultados, em conjunto, indicam que as células pouco ou não metastáticas derivadas de tumor primário SCC-9 podem ser mais sensíveis aos mecanismos de expressão de mRNAs de VEGFA e suas isoformas pelo ORL, pois as expressam mais do que as células metastáticas, principalmente nas maiores concentrações da droga.
A expressão de VEGFA e suas isoformas foi diferente entre as células SCC-9 e LN-1 tratadas com CDDP em algumas concentrações. Com relação a expressão de VEGFA
total, observamos que houve diferença estatística apenas na concentração relativa à 0,5 x a IC50 onde a LN-1 foi levemente maior do que a SCC-9. A expressão de VEGFA165 foi
estatisticamente superior na SCC-9 quando tratadas com as concentrações relativas à 0,5 e 1 x a IC50. Por outro lado, não foi observada diferença estatisticamente significante na expressão de VEGFA165b entre as duas linhagens celulares tratadas com diferentes concentrações de
CDDP. As células SCC-9 apresentaram maior expressão da isoforma VEGFA189 do que as
células LN-1 em todas as concentrações da droga, o que foi estatisticamente significante.E com relação à expressão de VEGFA121, na concentração relativa à 0,25 x a IC50, a LN-1 foi
estatisticamente superior do que a SCC-9, enquanto que na concentração relativa à 0,5 x a IC50, observamos que a SCC-9 foi estatisticamente superior à LN-1. Portanto, estes resultados em conjunto indicam que as células pouco ou não metastáticas derivadas de tumor primário SCC-9 podem ser mais sensíveis aos mecanismos de expressão de mRNAs de VEGFA e suas isoformas também pela CDDP. (Gráficos 7 B, 8 B, 9 B, 10B e 11 B).
Gráfico 7 – Comparação da expressão de VEGFA total entre as células SCC-9 e LN-1 tratadas com
ORL (A) e CDDP (B). A linhagem SCC-9 tratada com ORL em todas as concentrações testadas apresentou maior expressão de VEGFA total em comparação com a LN-1. O tratamento com CDDP, por sua vez, não causou grande alteração na expressão do mesmo conjunto de transcritos entre as duas linhagens estudadas (*p<0.01, ***p<0.0001; Teste t de Student não pareado; Barras de Erros representam o desvio padrão da triplicata experimental).
Gráfico 8 - Comparação da expressão de VEGFA165 entre as células SCC-9 e LN-1 tratadas com ORL
(A) e CDDP (B). As células LN-1 apresentaram maior expressão deste produto gênico na concentração referente a 0,25 x a IC50 do ORL, quando comparadas à SCC-9. O contrário foi observado nas demais concentrações testadas. Por sua vez, a isoforma VEGFA165 foi mais expressa pelas células SCC-9 do que a LN-1 quando tratadas com CDDP nas concentrações 0,5 e 1 x a IC50 (**p<0.001; Teste t de Student não pareado; Barras de Erros representam o desvio padrão da triplicata experimental).
Gráfico 9 - Comparação da expressão de VEGFA165b entre as células SCC-9 e LN-1 tratadas com
ORL (A) e CDDP (B). A expressão deste gene foi superior nas células SCC-9 tratadas com ORL em todas as concentrações testadas. Quando expostas à CDDP, as duas linhagems não apresentaram diferenças significativas na expressão de VEGFA165b (**p<0.001; Teste Mann Whitney; Barras de Erros representam o desvio padrão experimental).
Gráfico 10 - Comparação da expressão de VEGA189 entre as células SCC-9 e LN-1 tratadas com ORL
(A) e CDDP (B). Observou-se que este produto gênico é mais expresso pelas células
SCC-9 em todas as concentrações aqui analisadas. CDDP, por sua vez, apresentou maior efeito sobre as células SCC-9, quando comparadas à LN-1 em todas as concentrações da droga (*p<0.01, **p<0.001, ***p<0.0001; Teste t de Student não pareado; Barras de Erros representam o desvio padrão da triplicata experimental).
Gráfico 11 - Comparação da expressão de VEGA121 entre as células SCC-9 e LN-1 tratadas com ORL
(A) e CDDP (B). As células SCC-9 tratadas com ORL a 0,5 e 1 x a IC50 apresentaram
maior expressão deste produto gênico em relação à linhagem LN-1, enquanto que 0,25 x não a alterou. A expressão de VEGA121 nas células tratadas com CDDP foi superior na LN-1 na concentração 0,25 x a IC50, enquanto que a SCC-9 foi superior na concentração 0,5 x a IC50 (**p<0.001, ***p<0.0001; Teste t de Student não pareado; Barras de Erros representam o desvio padrão da triplicata experimental).
5.5 – ANÁLISE DA PRODUÇÃO DOS EXTRATOS PROTEICOS DE HIF-1Α E FASN