4. RESULTADOS
4.7. Componentes antigênicos de Dp bruto e FLConA reconhecidos por IgE
A capacidade de reconhecimento dos componentes presentes no extrato Dp
bruto e FLConA pela IgE foi avaliada, por Immunoblotting, em dez soros de
pacientes do grupo DP+ e dez soros de indivíduos do grupo NA.
Três soros representativos do grupo DP+, para o extrato Dp e sua fração
FLConA estão representados na FIGURA 6A, faixas 1 a 6). As colunas 7 e 8 ilustram
soros de indivíduos do grupo NA, testados com o extrato Dp e FLConA,
respectivamente.
Todos os soros do grupo DP+ (100%) testados foram reativos a pelo menos
A IgE sérica de pacientes do grupo DP+ reconheceu, em Dp bruto, sobretudo
componentes com massas moleculares aparentes de 14 a 17 kDa, 24 a 26 kDa, 55
a 62 kDa, 66 kDa, 71 kDa, 103 kDa, and 116 kDa.
A freqüência percentual relacionada ao reconhecimento destes componentes
por parte da IgE dos pacientes alérgicos apresentou valores variáveis. No grupo
DP+, uma ampla percentagem IgE sérica dos pacientes (90%) reconheceu
componentes com massas moleculares entre 14 e 17 kDa, além disso, 80% dos
soros apresentaram um reconhecimento de bandas entre 22 a 26 kDa e 60%
reconheceram o componente de 103 kDa. Opostamente, nenhum dos soros dos
indivíduos do grupo NA apresentaram reconhecimento de componentes do extrato
Dp bruto.
Em FLConA, observou-se uma predominância no reconhecimento de
componentes da massas moleculares altas, sendo que aqueles que apresentaram
valores iguais a 66 KDa, 81 kDa e 116 kDa foram os mais reconhecidos (86%, 71%
e 71%, respectivamente). Ao contrário de Dp bruto, os componentes de FLConA
com valores de 14 a 17 kDa, 35 kDa e 95 kDa não foram reconhecidos por nenhum
soro dentre os pacientes alérgicos. Do mesmo modo, não houve reconhecimento de
quaisquer componentes desta fração por parte da IgE proveniente do soro de
indivíduos do grupo NA.
A FIGURA 6B reporta a freqüência percentual de componentes reconhecidos
A 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0
Massa molecular aparente (kDa) B 1 4 -1 7 2 2 -2 6 2 9 3 5 5 5 -6 2 5 7 6 3 6 6 7 1 8 1 9 5 1 0 3 1 1 6 FLC onA D p bruto F re q u ê n c ia ( % ) 1 2 3 4 5 6 7 8 14 20 24 29 36 50 66 84 116 Mr (kD a)
FIGURA 6. (A) Componentes do extrato bruto de D. pteronyssinus (Dp bruto, faixas 1 a 3) e fração
ligante de Concanavalina A (FLConA, faixas 4 a 6) reconhecidos por três soros de pacientes do grupo DP+ por meio de Immunoblotting. O soro de um indivíduo do grupo NA foi reagido com Dp
bruto (faixa 7) e FLConA (faixa 8). As massas moleculares de referência estão indicadas, em kilodaltons. A freqüência percentual (B) das bandas reconhecidas pelos pacientes do grupo DP+ também estão reportadas.
Alérgenos geralmente são constituídos por um grande número de proteínas,
dentre elas, incluindo glicoproteínas. Alguns epítopos destes alérgenos consistem de
cadeias de carboidratos (STEWART; THOMPSON, 1996), constituindo sítios
imunogênicos - epítopos de células T - ou sítios de ligação de IgE - epítopos de
células B -, que variam em tamanho e quantidade. A diversidade de reatividade
dessas glicoproteínas está intimamente ligada a esses fatores (MALANDAIN, 2005).
Devido à sua afinidade por componentes que contenham carboidratos, as
lectinas são freqüentemente utilizadas na obtenção de extratos glicosilados (GUPTA
et al., 1996; VAN DIE et al., 2000) e a ConA é uma destas. Ela é uma lectina vegetal
que geralmente apresenta sítios de ligação aos açúcares comuns α-D-manose e β- D-glicose, além de resíduos estereoquimicamente relacionados a estes (SCRIBA,
2004). Devido a esse fato, ensaios imunológicos e bioquímicos, utilizando a ConA,
têm sido desenvolvidos com a finalidade de isolar esses componentes e determinar
suas funções biológicas (GUPTA et al., 2004).
No presente estudo, frações não ligantes (FNLConA) e ligantes (FLConA)
dessa lectina foram obtidas do extrato bruto de D. pteronyssinus, por cromatografia
de afinidade de ConA-Sepharose. Essas frações foram visualizadas por SDS-PAGE,
que revelou um perfil de componentes complementar ao extrato Dp bruto, no qual
bandas protéicas que estavam presentes em Dp bruto antes do fracionamento foram
também visualizadas em uma das frações.
Na FNLConA, os componentes protéicos apresentaram massa molecular
aparente na faixa de 14 a 30 kDa, possivelmente constituídos por proteínas, ou
ConA, como por exemplo, derivados de α-D-manose e β-D-glicose, anteriormente mencionados.
Por outro lado, o perfil eletroforético revelou uma amplitude maior na FLConA,
quanto à presença de componentes. Várias bandas protéicas, com massas
moleculares aparentes de 22 a 116 kDa, foram visualizadas e uma similaridade, na
faixa compreendida entre as bandas de 20 a 30 kDa, foi notada, quando
comparadas à FNLConA. Esse fato não implica que estes componentes apresentam
a mesma composição bioquímica, pois, possivelmente os elementos presentes na
FLConA se constituem de moléculas que contenham cadeias de carboidratos
ligantes de ConA. Opostamente, a FNLConA pode ser composta de proteínas
simples ou de glicoproteínas não ligantes a essa lectina.
Até o momento, pelo menos dezenove grupos de alérgenos originados de
ácaros do gênero Dermatophagoides já foram caracterizados e a maioria deles são
descritos como proteínas de baixa massa molecular (em torno de 14 a 60 kDa) ou
glicoproteínas com estruturas e propriedades bioquímicas diversificadas (THOMAS
et al., 2002; STEWART; THOMPSON, 1996).
Estudos apontam que os alérgenos mais importantes do gênero
Dermatophagoides estão incluídos no grupo 1 (aproximadamente 25 kDa) e no
grupo 2 (aproximadamente 14 kDa), por serem reconhecidos por mais de 80% dos
pacientes alérgicos a esses ácaros (HALES; SHEN; THOMAS, 2000; HALES et al.,
2002).
Dentre os alérgenos de D. pteronyssinus, alguns podem apresentar potenciais
sítios de glicosilação, como relatado por Kawamoto et al. (2002) e Thomas; Smith
kDa, 25 kDa, 26 kDa, 57 kDa e 103 kDa, que correspondem aos alérgenos dos
grupos 7, 1, 8, 4 e 11, respectivamente. Alguns desses valores de massa molecular
também foram encontrados no presente estudo, como demonstrado por SDS-PAGE,
sugerindo que a cromatografia de afinidade de ConA-Sepharose isolou, de maneira
efetiva, alguns glicoconjugados do extrato bruto de D. pteronyssinus.
Um componente com massa molecular aparente de 25 kDa foi visualizado em
ambas as frações, bem como no próprio extrato Dp bruto. Uma possível explicação
para esse fato se remete na descrição de antígenos diferentes e com massas
moleculares semelhantes, além da presença (alérgenos do grupo 1) ou ausência
(alérgenos dos grupos 3 e 6) de sítios de glicosilação, como descrito por Kawamoto
et al. (2002). Desta forma, uma melhor compreensão deste achado poderá ser
validada através de estudos detalhados sobre a estrutura molecular deste elemento.
As bandas protéicas com massas moleculares abaixo de 10 kDa presentes no
extrato bruto de D. pteronyssinus podem atuar como haptenos (THOMAS; SMITH,
1998) . A diálise em sistema Amicon utilizado nesse estudo explica possivelmente a
ausência dessas bandas protéicas, pois foram utilizadas membranas com ponto de
corte igual a 10 kDa, implicando em perda de componentes protéicos menores a
esse valor.
A seleção dos pacientes participantes desse estudo foi feita por meio de
avaliação clínica e TCP. Com relação ao diagnóstico clínico, todos os pacientes
alérgicos selecionados apresentaram sintomas característicos de rinite e uma
pequena porcentagem relatou a presença de sintomas sugestivos de asma.
Voorhorst (1977) associou a presença de ácaros do gênero
incluindo rinite e asma. No presente estudo, todos os pacientes alérgicos foram
positivos ao TCP para os extratos de D. pteronyssinus e D. farinae, sendo que a alta
freqüência de positividade a este último, através do TCP, pode ser explicada pelos
altos índices do alérgeno (Der f 1) desse ácaro encontrado no município de
Uberlândia, por Sopelete et al. (2000), maiores inclusive que os de D. pteronyssinus
(Der p 1), por meio de coleta de poeira domiciliar e dosagem in vitro desses
alérgenos por ELISA.
A resposta de IgE a Dp bruto e sua fração ligante de ConA foi avaliada pelos
ensaios ELISA e Immunobloting. O ensaio imunoenzimático tem sido utilizado como
uma das principais técnicas in vitro no diagnóstico de alergias, de forma
complementar ao TCP. Sua adoção na dosagem de anticorpos reativos a antígenos
presentes nas frações ligantes de ConA foi relatada em décadas passadas, por
Baldo e Uhlenbruck (1977) e Stewart e Turner (1980), em extrato de
Dermatophagoides, porém, o perfil de reconhecimento das bandas protéicas
presentes na fração ligante de ConA derivada de D. pteronyssinus, pela IgE de
pacientes alérgicos, por Immunoblotting, não foi avaliado até o momento.
A resposta anticórpica foi distinta entre os componentes testados, exceto
entre Dp bruto e FNLConA. O índice de reatividade semelhante entre o extrato bruto
e a fração que não apresentou afinidade com ConA e a diferença para com a fração
ligante é explicada pela separação de epítopos. Nesse contexto, o fracionamento de
Dp bruto, por cromatografia de afinidade de ConA-Sepharose foi responsável por
isolar componentes antigênicos que foram reconhecidas pela IgE de alguns
pacientes. Devido à diminuição na quantidade de componentes presentes em
epítopos, que certamente estariam na FNLConA. A presença de epítopos
imunodominantes selecionados nessa fração seria um importante fator de reflexão
sobre a utilização desse extrato em imunoterapia hipossensibilizante, uma vez que
aumentaria sua especificidade e diminuiria a sensibilização dos pacientes a novos
epítopos, pois a imunoterapia utilizando o extrato bruto expõe os pacientes a todas
as proteínas presentes no extrato, mesmo àquelas que seus anticorpos antes não
reconheciam. Para isto, será necessária uma exploração a respeito do mecanismo
de resposta imune aos componentes presentes em FLConA no contexto de
apresentação antigênica e ativação de células T.
A análise do perfil de bandas revelou que os soros dos pacientes do grupo
DP+ reconheceram com maior freqüência componentes de alta massa molecular,
contrastando com um estudo de Hong; Lee; Oh (1991), onde a maior prevalência de
reconhecimento pela IgE foi de bandas protéicas de baixa massa molecular.
Uma alta correlação positiva verificada entre os extratos é reflexo da
existência de uma similar alergenicidade entre extrato Dp e frações ligantes e não
ligantes de ConA. Entretanto, uma correlação discretamente alta foi observada entre
Dp bruto e FNLConA, quando comparado à FLConA. Uma explicação para isso se
deve aos alérgenos de grande importância na sensibilização, como por exemplo Der
p 2 (THOMAS et al., 2002). Uma banda protéica com massa molecular aparente
semelhante a este alérgeno foi encontrada em Dp bruto e FNLConA, o que pode
sugerir a sua presença. Entretanto, somente a utilização de técnicas mais
específicas poderá elucidar este fato.
A reatividade cruzada entre os ácaros é descrita como uma co-variação da
pteronyssinus e D. farinae, devido aos 80% e 88% de homologia observados entre
os alérgenos de 25 kDa (grupo 1) e 14 kDa (grupo 2), como discutido por Sidenius et
al. (2001). Os resultados do presente estudo confirmam essa reatividade cruzada,
uma vez que a suspeita desse fato, dado pela co-positividade entre esses ácaros,
pelo TCP, foi confirmada pelo ELISA de inibição competitiva, onde uma inibição
heteróloga de Dp bruto por Df bruto foi observada. Além disso, houve uma inibição
homóloga tanto por Dp bruto quanto por FLConA, quando ambos foram aplicados na
fase sólida.
Com relação ao extrato Bt bruto, o ensaio imunoenzimático realizado nas
concentrações empregadas nesse estudo mostrou uma irrelevante reatividade
cruzada entre D. pteronyssinus e B. tropicalis, contrariamente aos estudos
publicados por Arruda et al. (1997), que justificaram a homologia entre os antígenos
desses ácaros como uma causa de 33% de reatividade cruzada encontrada, por
ELISA.
Estudos apontam que glicoconjugados são freqüentemente reconhecidos
pela IgE humana e que os chamados carboidratos determinantes de reatividade
cruzada são geralmente responsáveis pelas reatividades entre extratos alergênicos
de espécies não relacionadas (MARI et al., 1999). Adicionalmente, para que estes
conjugados possam exercer uma atividade biológica considerável, há a necessidade
da presença de epítopos polivalentes de carboidratos, como mencionado por Fötish
et al. (1999), e alguns desses já foram caracterizados em plantas. Em um estudo
conduzido por Iacovacci et al. (2001), realizado em plantas, os epítopos
glicoprotéicos de cipreste (Cupressus amazonica) reconhecidos pela IgE de
interessante é que, além desses epítopos, os anticorpos dos pacientes
reconheceram glicoproteínas de extratos de outros polens. Nesse sentido, a
reatividade cruzada observada nesse estudo poderia estar intimamente relacionada
aos carboidratos, uma vez que os extratos aplicados na fase sólida apresentavam
quantidades consideráveis dessas biomoléculas.
O ensaio de immunobloting revelou que varias bandas protéicas foram
reconhecidas simultaneamente por Dp bruto e FLConA. Algumas dessas bandas
não estão descritas na literatura com os mesmos valores de massa molecular, no
entanto, como um mesmo alérgeno pode se constituir de carboidratos ligantes e não
ligantes de ConA, possivelmente o fracionamento do extrato Dp resultou na
separação de glicoproteínas que apresentaram afinidade com a ConA, como por
exemplo α-D-manose e β-D-glicose.
Portanto, uma investigação a respeito dos sítios glicosilados presentes na
FLConA e reconhecidos pela IgE de pacientes alérgicos a Dermatophagoides
precisará ser realizada, de modo a esclarecer o seu papel na resposta imune. De
forma complementar, a utilização desta fração como uma potencial ferramenta em
estudos de exposição, sensibilização e imunoterapia específica poderão ser também
• A cromatografia de afinidade de ConA-Sepharose é uma importante ferramenta envolvida no fracionamento de componentes glicosilados derivados de
Dermatophagoides pteronyssinus;
• Frações não ligantes e ligantes de Concanavalina A (ConA) derivados de D. pteronyssinus se constituem de componentes capazes de induzir a síntese de
IgE em pacientes alérgicos;
• Alérgenos presentes no extrato bruto de D. pteronyssinus e em suas frações ligantes de ConA podem apresentar uma reatividade cruzada homóloga entre si
e heteróloga com alérgenos de D. farinae, frente a IgE de pacientes alérgicos;
• Componentes do extrato bruto de D. pteronyssinus e de suas frações ligantes de ConA apresentam perfis diferentes no reconhecimento por parte da IgE, sendo
que estes anticorpos parecem reconhecer bandas protéicas de alta massa
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