Comportamento ingestivo

O comportamento ingestivo foi avaliado, em cada período experimental, por meio do monitoramento visual, no qual foram observadas as atividades de alimentação, ruminação e ócio dos animais durante 24 horas (MAEWAKA et al., 2002), com início e término às 8h da manhã do 17o _{e 18}o _{dia experimental em cada um dos}

períodos. As atividades foram anotadas a cada 5 minutos, onde um evento foi definido como, no mínimo, 5 minutos de atividade seguido por, no mínimo, 5 minutos da mesma atividade. A soma de todos os eventos comendo representa o número diário de eventos comendo (eventos/dia). Da mesma forma, é calculado o número diário de eventos ruminando e ócio.

O tempo total comendo (min/dia) foi definido como a soma de todos os eventos comendo. O tempo médio comendo por evento (min/evento) foi obtido pelo tempo total comendo dividido pelo número de eventos comendo. Da mesma forma foram obtidos os tempos totais de ruminação e ócio e os tempos médios de ruminação e ócio por evento. O tempo total de mastigação (min/dia) foi calculado pela soma do tempo total

comento e do tempo total ruminando. O número diário de eventos de mastigação (eventos/dia) foi obtido pela soma do número de eventos comendo e o número de eventos ruminando, enquanto que o tempo médio de mastigação por evento (min/evento) foi calculado pela razão entre tempo total mastigando e o número de eventos de mastigação.

A taxa de ingestão (kg/evento) foi determinada como sendo a razão entre o consumo de MS e o número de eventos comendo. A taxa de ingestão de FDN (kg/ evento) foi determinada como sendo a razão entre o consumo de FDN e o número de eventos comendo. A taxa de ingestão de MS ou FDN (min/kg) foram determinadas pela razão entre tempo total comendo pelas quantidades médias de MS ou FDN ingeridas. A taxa de ingestão da MS ou FDN (kg/min) foram calculadas pela razão entre as quantidades médias de MS ou FDN ingeridas pelo tempo total comendo. Os mesmos cálculos seguem para as taxas de ruminação da MS ou FDN, bem como mastigação da MS ou do FDN (min/kg).

3.2.5. Coleta sanguínea

As amostras de sangue foram colhidas no 22º dia por punção da veia jugular externa, com agulha descartável 25x28 mm, em três tubos plásticos preparados para a colheita de sangue a vácuo (Sistema Vacutainer). O tubo contendo 7,2 mg de EDTA- K2 como anticoagulante (tubo de tampa roxa) e com vácuo suficiente para aspirar 4 mL de sangue era destinado à determinação do hemograma. O tubo sem anticoagulante e com gel ativador de coágulo era destinado à obtenção do soro para as análises bioquímicas. O tubo com 6 mg de fluoreto de sódio (agente antiglicolítico) e EDTA como anticoagulante foi destinado à obtenção do plasma e da concentração de glicose.

O sangue, após a colheita feita no 22º dia, era mantido sob refrigeração até o momento da realização dos exames, sempre concluídos antes de decorridas oito horas de conservação.

No laboratório de Análises Clínicas Veterinárias da USP de Pirassununga, os tubos com fluoreto de sódio e os tubos com gel ativador de coágulo foram centrifugados (Centrifuga Excelsa II, modelo 206 BL) durante 20 minutos à 2500 rpm para a formação do coágulo ou sedimentação dos elementos figurados do sangue. A seguir, o soro e o plasma foram pipetados em micro tubos, tipo Eppendorf, e as

amostras embaladas e conservadas em freezer a menos 20ºC até a realização das determinações.

3.2.6. Avaliação do hemograma

A determinação do número de hemácias (He), do hematócrito (Ht), dosagem de hemoglobina (Hb) e número total de leucócitos o volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) foram realizadas no contador automatizado BC-2800 Vet Mindray®_.

Esse equipamento utiliza o método de impedância para mensuração das hemácias e leucócitos e os métodos colorimétricos para determinação da hemoglobina.

Com o sangue “in natura” foram distendidos dois esfregaços sanguíneos destinados à contagem diferencial de leucócitos. Esses esfregaços, após secarem, foram corados utilizando-se o corante de Rosenfeld.

Os esfregaços eram contra-corados com corante de Rosenfeld e analisado no microscópio óptico em aumento de 1000X, contando-se 1000 hemácias e dentre essas as que foram corados fragmentos de RNA, os reticulócitos. O resultado foi expresso em número absoluto de reticulócitos (FERNANDEZ; GRINDEM, 2000).

3.2.7. Bioquímica sérica

A determinação dos teores séricos de proteína total foi feita pelo método do biureto, de acordo com a técnica preconizada por Gornall, Bardawwill e David (1949) e modificada por Strufaldi (1987), com leitura da coloração da reação utilizando comprimento de onda de 550 nm em Analisador Bioquímico Automático da marca Randox Daytona® _{- Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando-se kit comercial da}

marca Randox® _{referência TP4001.}

A determinação dos teores séricos de albumina foi feita pelo método do verde de bromocresol em analisador bioquímico automático da marca Randox Daytona® _-

Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando-se kit comercial da marca Randox®

referência AB3800, de acordo com a técnica preconizada por Doumas, Biggs e Watson (1971), sendo a leitura da coloração da reação realizada pelo comprimento de onda de 630 nm.

A atividade enzimática sérica da aspartato-aminotransferase e gama glutamiltransferase, assim como os teores séricos de ureia, foram determinadas segundo metodologia cinética otimizada em conformidade com o European Comitee for Clinical Laboratory Standards (ECCLS), em Analisador Bioquímico Automático da marca RX Daytona® _{- Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando kit comercial da}

marca Randox® _{referência AS3804 (aspartato-aminotransferase), GT3814 (gama}

glutamiltransferase) e UR3825 (ureia).

O teor sérico de lactato foi obtido por determinação enzimática correlacionando a ação catalítica da lactato oxidase, que é diretamente proporcional à quantidade de lactato na amostra. A leitura por espectrofotometria, utilizando comprimento de onda igual a 340 nm, foi realizada pelo analisador bioquímico automático da marca RX Daytona® _{- Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando kit comercial da marca}

Randox® _{referência LC3980. Os resultados foram expressos em mg/dL.}

3.2.8. Avaliação da hemogasometria

O sangue para a gasometria foi colhido no 22º dia, em seringas específicas heparinizadas com cálcio (Ca) balanceado da marca Monovette® _Sarstedt.

O sangue era rapidamente analisado no local utilizando hemogasômetro portátil i-STAT 1® _{(empresa Abbott) e cartuchos i-STAT}® _{EG7+, que consistem de um chip}

biossensor eletroquímico que realiza determinações à 37ºC para pH, pCO2 (pressão

parcial de dióxido de carbono em mmHg), pO2 (pressão de oxigênio em mmHg), Na

(sódio em mMol/L), K (potássio em mMol/L), iCa (cálcio ionizado em mMol/L) e hematócrito. A partir dessas determinações o sistema calcula valores para o HCO3

(bicarbonato em mMol/L), o TCO2 (dióxido de carbono total em mmHg), BEect

(excesso ou déficit de bases no sangue em mMol/L), sO2 (saturação de oxigênio em

%) e hemoglobina (g/dL). O pH, pCO2 e pO2 são convertidos para a temperatura do

animal.

3.2.9. Análise estatística

Os dados foram analisados pelo programa Statistical Analysis System (SAS, versão 9.3, 2010). Antes das análises propriamente ditas, os dados foram analisados em relação à presença de informações discrepantes (“outliers”), a normalidade dos

resíduos pelo teste Shapiro-Wilk e a homogeneidade das variâncias pelo teste Levene. Quando a premissa de normalidade não foi atendida, a transformação logarítmica ou pela raiz quadrada foi necessária.

Os dados foram analisados utilizando o PROC MIXED para modelos mistos. Os dados foram submetidos à análise de variância e o modelo incluiu o efeito de nível de nitrato e de genética como fatores fixos e os efeitos de animal dentro de genética e período como fatores aleatórios. Os efeitos de nitrato foram avaliados pela regressão polinomial. O modelo estatístico utilizado está descrito conforme a equação abaixo:

Yijkl = μ + Ti + Pj + Qk + Al(Qk)+ Eijkl

Onde:

Yijkl = observação referente ao nível de nitrato (i) + período (j) + genética (k) +

animal (l) dentro de genética (k);

μ = Média geral;

Ti = Efeito de nível nitrato (efeito fixo);

Pj = Efeito de período (efeito aleatório);

Qk = Efeito de genética (efeito fixo);

Al(Qk) = Efeito de animal dentro de genética (efeito aleatório);

Eijkl = Erro aleatório associado a cada observação.

Para os dados de digestibilidade, foi utilizado o peso metabólico como covariável.

3.3. RESULTADOS