Composição isotópica das plantas em δ

Os valores de delta 15N (δ15N) da planta-inteira de cana-de-açúcar indicaram que o N assimilado sofreu fracionamento dos isótopos de N (15N e 14N) em relação aos valores iniciais de δ15

N do N da solução nutritiva, apenas quando o NH4+ foi fornecido em proporções de NO3-/NH4+ ≤ 1, como pode ser observado na Figura 3.12. Quando as plantas exaurem completamente a fonte de N, os valores de δ15

N da planta-inteira ficam muito próximos ao da fonte de N; contudo, se somente uma parte do N for absorvida o fracionamento isotópico que ocorre entre o produto (planta) e o substrato (solução) pode afetar os valores de δ15

N tanto da planta como da solução remanescente de N, sem perturbar o equilíbrio geral do balanço isotópico de massas (YONEYAMA et al., 2001). Dessa forma, as plantas tornam-se enriquecidas ou empobrecidas isotopicamente em relação à fonte externa de N,

quando ocorre perda de N através da planta que normalmente é isotopicamente diferente, de menor valor, que o δ15

N médio da planta-toda.

Figura 3.12 – Assinatura isotópica expressa em 15N ‰ na planta-inteira de cana-de-açúcar e valor original de 15N‰ do N da solução nutritiva em função do suprimento de nitrato e/ou amônio. ns: indica que não houve diferença significativa (P ≤ 0,05) entre o δ15N da planta-inteira e solução nutritiva (fonte de N) enquanto o * indica que houve diferença significativa entre eles.

Quando a maior parte do N foi fornecida como NO3- (100/0, 75/25) o δ15N da planta-inteira (-3,43 ± 0,36 ‰ e -3,04 ± 0,84 ‰, respectivamente) não foi significativamente diferente do δ15_{N da fonte de N (-2,60 ± 0,15 ‰ e -3,22 ± 0,10 ‰,} respectivamente) (Figura 3.12). Este resultado era esperado visto que estudos anteriores, e que constam da literatura, descreveram valores de δ15

N da planta- inteira mais baixos ou próximos aos da fonte de N para diferentes concentrações de NO3-. (MARIOTTI et al., 1982; EVANS et al., 1996; YONEYAMA et al., 2001). Isto indica que no presente estudo não houve perdas de N nas plantas de cana-de- açúcar cultivadas com NO3-. Ao contrário disto, Ariz et al. (2011) relataram valores mais positivos de δ15

N na planta inteira em nove espécies de plantas alimentadas com NO3-, e associaram as perdas de N por efluxo de NH4+ e exsudados radiculares (EVANS, 2001; YONEYAMA et al., 2001; KOLB; EVANS, 2003) e/ou perdas de NH3 através dos estômatos (MATTSSON; SCHJOERRING, 1996; MATTSSON; HUSTED; SCHOERRING, 1998; MASSAD et al., 2010). Isso porque o NH3 da folha é originado predominantemente da fotorrespiração e pode ter valores de δ15

N de até Proporção de NO₃- /NH₄+ 100/0 75/25 50/50 25/75 0/100 Delta 15 N (‰) -10 -8 -6 -4 -2 0 2 Planta-inteira Solução Nutritiva * * * ns ns

- 40‰ (HANDLEY et al., 1999; PEUKE et al., 2006), e o 14NH3 é perdido mais rapidamente pelos estômatos que o 15NH3 (ODEEN, 1989).

Ariz et al. (2011) observaram aumento na discriminação isotópica de N em espécies de plantas que são suscetíveis à toxidez de amônio, comparada com espécies tolerantes. Assim, os autores propuseram que plantas com menor tolerância a nutrição amoniacal são mais empobrecidos no isótopo mais pesado de N (15N), e apresentam, portanto, valores mais negativos de δ15N. Estes valores variaram de -8 a -15 ‰ nas espécies consideradas mais sensíveis, como alface, espinafre e tomate, ficando relativamente próximos aos valores encontrados no presente estudo para plantas de cana-de-açúcar nutridas somente com amônio (-7,92‰).

Os valores médios de δ15

N da planta-inteira, crescidas com proporções de NO3-/NH4+ ≤ 1 revelaram empobrecimento do isótopo mais pesado de N (15N) (Figura 3.12). Esses resultados estão de acordo com os encontrados por Ariz et al. (2011) que relataram tendência de aumento no empobrecimento isotópico com o aumento da concentração de N para a maioria das nove espécies avaliadas, quando as plantas foram nutridas somente com NH4+. O fracionamento isotópico que causa empobrecimento do isótopo mais pesado (15N) na planta-inteira com o fornecimento único de NH4+ pode ser oriundo de alguns processos, como: (i) algumas moléculas de NH4+ enriquecidas em 15N podem ser liberadas das raízes, depois da assimilação do NH4+ pela GS em elevadas concentrações de NH4+, podendo contribuir significativamente com o empobrecimento do 15N em plantas alimentadas com NH4+ (YONEYAMA et al., 2001; ARIZ et al., 2011); ii) possivelmente há alta concentração de NH3, produzida no equilíbrio NH4+/NH3, no meio com alta concentração de NH4+. O NH3 produzido é empobrecido no isótopo mais pesado (até -20‰) e apesar de representar uma fração muito pequena do total de NH4+, apresenta rápida difusão através da membrana, tornando os valores de 15N‰ do NH3 absorvidos significativos, a ponto de empobrecer a planta-inteira (YONEYAMA et al., 2001; ARIZ et al., 2011).

Os valores de δ15

N internos da planta, ou seja, nos compartimentos da cana- de-açúcar, sofreram fracionamento em relação os valores iniciais de δ15

N da solução nutritiva (Figura 3.13). Em plantas terrestres vasculares o fracionamento do 15N e 14N está associado com a assimilação inicial do N exógeno de fontes externas por meio de vias distintas; alocação interna; remobilização; trocas gasosas e perdas de N pela

planta (HANDLEY; SCRIMGEOUR, 1997). Segundo os autores em casos de fracionamento interno na planta esses são causados por enzimas e não por processo de transporte físico. Isso porque mais energia é necessária para quebrar ou formar ligações químicas envolvendo compostos contendo o 15N do que com o 14

N. Em média, moléculas que contém o isótopo mais leve (14N) reagem mais rapidamente (por exemplo, com uma enzima) do que aqueles que contêm o isótopo mais pesado (15N) (ROBINSON, 2001). Dentre as perdas inclui-se: efluxo de N pelas raízes das plantas, exsudação de aminoácidos e peptídeos, perdas gasosas a partir da parte aérea das plantas e perda das partes das plantas, como frutos e folhas velhas (MARIOTTI et al., 1982; HANDLEY; SCRIMGEOUR, 1997; YONEYAMA et al., 1997).

Os valores de δ15

N de plantas nutridas com NH4+ e NO3- variaram de -8,127 a 5,022 ‰ em relação à fonte de N, sendo significativamente diferentes com a forma de N fornecida às plantas e compartimento vegetal (Figura 3.12). De modo geral, a partir dos resultados da assinatura isotópica natural observou-se a seguinte tendência (Figura 3.12): plantas alimentadas com as maiores proporções de NO3- tendem a ser mais enriquecidas, no isótopo mais pesado de N, principalmente nas folhas das plantas, enquanto plantas alimentadas com maiores proporções de NH4+ tiveram o δ15N reduzido, ou seja, foram empobrecidas em 15N (-3 a -8 ‰) em comparação com a fonte de N, em todos os compartimentos vegetais (Figura 3.12). Esses valores de δ15

N são decorrentes dos diferentes padrões de assimilação de NO3- e NH4+ na planta. O δ15N das folhas pode ser maior do que o das raízes em plantas alimentadas com nitrato porque o nitrato disponível para assimilação nas folhas é enriquecido em relação ao nitrato das raízes, uma vez que ele se origina de um pool que tem sido exposto à assimilação (EVANS, 2001). Por outro lado, o empobrecimento relativo nos valores de δ15

N em plantas nutridas com amônio pode ser oriundo do próprio processo de absorção de NH4+, sendo que quanto maior a quantidade absorvida deste cátion, mais negativo são os valores de δ15

N na planta (YONEYAMA et al., 1991). Os autores também encontraram valores de δ15

N na parte aérea e raízes maiores do que em constituintes orgânicos nitrogenados, sugerindo que também ocorre fracionamento durante a assimilação do amônio, sendo esse fracionamento dependente da concentração de amônio, da espécie e do cultivar.

Figura 3.13 – Valores de δ 15_{N (‰) nas raízes, colmos, folhas verdes e folhas secas de plantas de} cana-de-açúcar supridas com nitrato e/ou amônio como forma de N. Letras maiúsculas comparam os compartimentos vegetais dentro do mesmo tratamento (proporção de NO3

- /NH4

+

) e letras minúsculas comparam o tratamento dentro do mesmo compartimento vegetal.

Evans et al. (1996) não observaram nenhuma variação interna do δ15

N em plantas de tomate cultivadas com NH4+, enquanto que o δ15N nas folhas foi maior que o das raízes em plantas crescidas com NO3-. No presente estudo, esta tendência também foi observada para a cana-de-açúcar, embora plantas cultivadas somente com amônio apesentaram menor empobrecimento em 15N nas folhas velhas do que no colmo, folhas verdes e raízes das plantas (Figura 3.13).

Embora a absorção de NO3- não cause fracionamento do 15N na planta- inteira, resultando em valores de δ15

N na planta próximos aos da fonte aplicada (YONEYAMA et al. 2001), no presente estudo os valores de δ15

N das raízes de plantas alimentadas por NO3- foram negativos (-1,6 ‰), provavelmente devido a outros processos que causam fracionamento, como redução do nitrato e assimilação do amônio. O processo de redução de NO3- à NO2- na planta é responsável pelo fracionamento do N nítrico. Mariotti et al., (1982) encontraram menor empobrecimento no isótopo mais pesado de N (15N) em plantas de milheto (Pannisetum americanun e P. mollissinium) alimentadas com nitrato com o aumento da atividade da NR nessas plantas.