COMPOSTOS FENÓLICOS (Identificação e quantificação)

Os compostos fenólicos foram isolados dos óleos usando dois procedimentos analíticos: Extração por Fase Sólida (EFS), descrita por Bennett e col. (1996) e Extração por Partição (EP), descrita por Taylor e col. (1997). Na técnica EP os alquilfenóis foram removidos do óleo com uma solução de hidróxido de sódio em metanol e posterior acidificação. Infelizmente, o método de EP não é satisfatório para a extração de óleos biodegradados devido à formação de emulsão. Na técnica de EFS os compostos fenólicos foram isolados através da extração por fase sólida com fase reversa C18 (NEC) em combinação com hexano para a eluição dos hidrocarbonetos HS e HPA, seguido de diclorometano para eluição dos compostos fenólicos. A derivatização dos compostos fenólicos, com N,O-bis(trimetilsilil)-trifluoracetamida (BSTFA), auxiliou no estudo da mistura fenólica por CG/EM melhorando a resolução dos diferentes isômeros nas colunas DB-5 e HP-1 utilizadas. A resolução e ordem de eluição, nas duas colunas, foram exatamente às mesmas. O estudo de compostos fenólicos pode ser feito sem transformá-los em derivados, no entanto ocorre uma deteriorização da coluna o que leva a cortes freqüentes de alguns centímetros nas duas extremidades, diminuindo assim o tempo útil da coluna.

Para auxiliar na identificação dos diferentes isômeros, uma mistura comercial dos padrões, fenol, C2-fenóis e C3-fenóis, foi submetida à extração por fase sólida, seguida de reação com BSTFA. Os compostos foram identificados por CG/EM e o cromatograma reconstituído de íons (RIC) (Figura 3.5, pág. 51) apresenta uma boa resolução para todos os isômeros. O espectro de massas dos isômeros de posição, para a mesma série homóloga, C1-fenóis, C2-fenóis, C3-fenóis, são exatamente iguais, Figuras 3.6 (pág. 51), 3.7 (pág. 52) e 3.13 (pág. 56), respectivamente. O fragmento intenso em m/z (M⁺- 15) corresponde à perda de um grupo metila do derivado trimetilsilano, comum em todos os compostos identificados. O tempo de retenção passa a ser o único dado diferente, entre os isômeros de uma mesma serie homóloga.

O fenol presente nos óleos A, C, F e G foi estudado através do seu derivado trimetilsilano pelo RIC característicos: m/z 166, e aqui representado pelo óleo A (Figura 3.6, pág. 51). O espectro de massas para o fenol-trimetilsilano apresenta o fragmento M⁺- 15 intenso (m/z 151) e o íon molecular m/z 166 (Figura 3.6, pág. 51).

Figura 3.5 RIC m/z 166, 180, 194 e 208 para estudo dos alquilfenóis da mistura de padrões.

Figura 3.6 RIC m/z 166 para o fenol-trimetilsilano obtido por EFS e EP nos óleo A e mistura de padrões. Espectro de massas do fenol-trimetilsilano.

Os compostos metilfenóis conhecidos por orto-(o), meta-(m) e para-(p)-cresóis foram estudados como metilfenol-trimetilsilano (MF), por CG/EM através do RIC m/z 180 (Figura 3.7, pág. 52). Boa resolução e reprodutibilidade foram obtidas para a mistura de padrões e o óleo de referência Miller (M) (Figura 3.7, pág. 52). O espectro de massas confirma a perda da metila presente no grupo trimetilsilano com o fragmento M⁺- 15 (m/z 165). Todos os isômeros o-, m-, e p-cresol-trimetilsilano apresentam no espectro de massas o mesmo padrão de fragmentos, não sendo possível com este dado de massas fazer distinção entre os isômeros. Por outro lado,

o tempo de retenção, comparado com a mistura de padrões, permitiu identificar com segurança os isômeros o-, m-, e p-cresol (Figura 3.7).

Figura 3.7 RIC m/z 180 para o cresol-trimetilsilano obtido por EFS e EP no óleo M e mistura de padrões. Espectro de massas do cresol-trimetilsilano.

Os métodos de análises EFS e EP forneceram para o óleo M, diferenças para os compostos identificados no RIC m/z 180, o-. p- e m-cresol. Após EP, o óleo M apresenta no RIC m/z 180 (Figura 3.8, pág. 53) o pico Y com tempo de retenção maior do que o isômero p-cresol. Diante dos resultados resolvemos trabalhar a mistura de padrões, fenol, o-cresol, m-cresol e p-cresol (S), nas mesmas condições da extração alcalina, EP, em que os óleos estudados tinham sido submetidos.

Novamente temos no RIC m/z 180, para a mistura de padrões (S), o mesmo composto Y encontrado no óleo de referência (M) (Figura 3.8, pág. 53) e nos outros óleos estudados A, C, F e G (Figura 3.10, pág. 54).

Figura 3.8 Comparação entre os métodos de análise EFS e EP para RIC m/z 180 do óleo M (óleo referência) e padrão S.

Comparando o óleo M nos métodos de análise por EFS (M) e EP (MP) para a mesma quantidade de óleo (80 mg) observamos nos dois métodos, diferenças na quantidade absoluta de cada cresol recuperado, como mostra o gráfico de barras (Figura 3.9). Na mistura de padrões (S) temos a mesma quantidade para estes isômeros (Figura 3.9).

Figura 3.9 Gráfico em barra para o-, m-, e p-cresol-trimetilsilano obtido do óleo M por EFS (M) e EP (MP) e mistura de padrões S.

No RIC m/z 180, o composto Y aparece como o composto principal nos óleos A, C, F extraídos por EP (Figura 3.10). Por outro lado, os isômeros o-, m- e p-cresóis isolados por EP apresentam nestes mesmos óleos praticamente a mesma distribuição e a mesma proporção relativa entre eles em cada óleo (Figura 3.10). No

óleo G, biodegradado, a proporção relativa para os isômeros cresóis e composto Y, foi distinta quando comparamos aos outros óleos.

De maneira geral podemos dizer que os dois métodos de análise EFS e EP forneceram a mesma distribuição de alquilfenóis, mas diferenças na quantidade absoluta dos isômeros dentro de um mesmo óleo.

Figura 3.10 RIC m/z 180 para o cresol-trimetilsilano obtido por EFS e EP nos óleos A, C, F e G.

A quantificação por EFS dos alquilfenóis em óleos brutos foi feita usando padrões internos 2,4-dimetilfenol deuterado (D3) (1 mg/10 mL) e fenol deuterado (1 mg/25 mL), 3 L de cada composto foi adicionado à coluna de EFS junto com

óleo. O fator de correção foi considerado 1 para todos os compostos. A área do pico desejado (C) foi calculada em cada RIC (m/z característicos 166; 180; 194 e 208) levando-se em consideração a área do padrão interno (PI) e a quantidade do óleo analisado, segundo Equação 2 abaixo.

eq. (2)

Com base nos cálculos da Equação 2 os óleos A, C, F e G apresentaram para fenol e cresóis quantidades absolutas diferentes para cada óleo (Figura 3.11). O gráfico de barras mostra que os óleos têm concentração de fenol variando de 0,4 g/g (óleo F) a aproximadamente 0,8 g/g (óleo C) (Figura 3.11). Os 3 isômeros cresóis estão em maior quantidade no óleo C, e menor quantidade no óleo G. Entre os isômeros podemos dizer que no óleo A o isômero o-cresol e o composto principal.

No óleo C o isômero p-cresol tem cerca de 0,16 μg/g de óleo e o isômero o-cresol valor entorno de 0,14 μg/g de óleo. No óleo F o m-cresol aparece como o isômero principal com valor baixo, cerca de 0,04 μg/g de óleo (Figura 3.11).

Figura 3.11 Gráfico em barra comparando a quantidade absoluta de fenol e cresóis nos óleos A, C, F e G obtido por EFS.

Óleos não degradados, segundo Ioppolo-Armanios (1996), apresentam concentração relativa alta de alquilfenóis. Nos óleos biodegradados com níveis variando de moderada a alta, os alquilfenóis estão em quantidade muito difíceis de serem detectados. De acordo com os dados dos biomarcadores Hidrocarbonetos Saturados (HS) (item 3.1) e Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) (item 3.3), os óleos A,C, CM, FU e F foram classificados como óleos não biodegradados,

   

   

   

área (C) 1000

Concentração ( g/g) = x xPI ( g)

área (PI) óleo (mg)

 

e o óleo G como um óleo biodegradado de nível 4 (Lima, 2005). Uma vez que os alquilfenóis são compostos muito solúveis em água, a remoção de fenóis, via partição com a água que caminha junto com o óleo durante a migração, em associação ao efeito de biodegradação, talvez justifiquem os baixos níveis de fenóis no óleo biodegradado G. Taylor e col. (1993) também observam um acréscimo na concentração de C2- e C3-alquilfenóis e um decréscimo de C1-alquilfenóis com o aumento da biodegradação.

Os isômeros de posição dos dimetilfenol-trimetilsilano (DMF) m/z 194 e trimetilfenol-trimetilsilano (TMF) m/z 208 para os óleos A, C, F e G foram identificados seguindo a mesma metodologia de comparação do tempo de retenção com a mistura de padrões (S) e com o óleo M (Figura 3.12) e (Figura 3.13) respectivamente.

Figura 3.12 RIC m/z 194 para o dimetilfenol-trimetilsilano (DMF) obtido por EFS nos óleos Miller e mistura padrão. Espectro de Massas para DMF.

Figura 3.13 RIC m/z 208 para o trimetilfenol-trimetilsilano (TMF) obtido por EFS nos óleos Miller e mistura padrão. Espectro de massas para TMF.

Nas duas metodologias, EFS e EP, o isômero 2,6-DMF é o constituinte principal no RIC m/z 194, para os óleos A, C, F e G (Figura 3.14). Os óleos C e F apresentam abundância relativa alta para todos os isômeros isolados por EFS (Figura 3.14).

Taylor e col. (1993) também observam um acréscimo na concentração de C2- e C3 -alquilfenóis e um decréscimo de C1-alquilfenóis com o aumento da biodegradação.

Figura 3.14 RIC m/z 194 para o trimetilfenol-trimetilsilano (TMF) obtido por EFS e EP nos óleos A, C, F e G.

No RIC m/z 208, o isômero 2,4,6-TMF apresenta abundância relativa alta para os óleos, A, C, F e G isolados por EFS (Figura 3.15, pág. 58). O óleo F apresenta basicamente a mesma abundância relativa para todos os constituintes. Novamente

na extração por partição EP, a proporção relativa entre os isômeros muda para cada óleo (Figura 3.15). O óleo A apresenta como constituinte principal um composto marcado com , o qual encontra-se em fase de identificação estrutural. Nos óleos C, F e G, este composto  está presente em menor proporção, comparado aos isômeros trimetilfenol (TMF).

Figura 3.15 RIC m/z 208 para os trimetilfenol-trimetilsilano (TMF) obtidos por EP e EFS nos óleos A, C, F e G.

Os compostos das classes MF, DMF, TMF e TeMF identificados nos óleos estudados estão resumidos na Tabela 3.5 (pág. 60). As Tabelas 3.6 (pág. 61) e 3.7 (pág. 62), a seguir, mostram a distribuição e concentração dos isômeros cresóis encontrados nos óleos estudados por EFS e EP. Na análise de EFS (Tabela 3.6, pág. 61), os óleos A e G apresentam uma distribuição isomérica predominante do composto orto substituído e uma abundância relativa semelhante para os compostos

meta e para substituídos. O óleo C apresenta uma distribuição isomérica predominante dos compostos orto e para substituídos e uma baixa abundância relativa do isômero meta substituído. O óleo F apresenta uma distribuição isomérica predominante do isômero meta substituídos dominando essa classe de isômeros.

Uma possível origem a partir de produtos naturais pode explicar a abundância relativamente alta do isômero meta substituído no óleo F.

Na análise de EP (Tabela 3.7, pág. 62), os óleos A, C e F apresentam uma distribuição isomérica predominante do composto orto substituído e uma abundância relativa semelhante para os compostos meta e para substituídos. O óleo G apresenta uma distribuição isomérica predominante de compostos orto e para substituídos e uma baixa abundância relativa do isômero meta substituído.

As duas metodologias EFS e EP apresentam diferenças nas quantidades relativas dos isômeros: fenol; o-cresol; m-cresol e p-cresol (Figuras 3.9, pág. 53;

3.10, pág. 54 e 3.11, pág. 55). Os fenóis orto e para substituídos são produtos cinéticos de reações de substituição eletrofílica aromática. Alguns autores propõem que esses alquilfenóis são formados por processos geosintéticos envolvendo alquilação de fenóis simples na rocha geradora. Enquanto que os fenóis meta substituídos são obtidos de vários produtos fenólicos naturais que podem sofrer clivagem em ambiente sedimentar resultando compostos de cadeia n-alquil mais curta predominantemente meta substituídos. Um dos produtos naturais que poderiam fornecer monoalquilfenóis meta substituídos são os 5-n-alquil-1,3-benzenodióis encontrados em querogênio derivado de G. prisca e alquilfenóis meta-substituídos de cadeia curta em bactérias aeróbicas de solo e hepáticas (Ioppolo-Armanios, 1996).

As Tabelas 3.6 (pág. 61) e 3.7 (pág. 62), mostram a distribuição e concentração dos isômeros dimetilfenóis encontrados nos óleos estudados por EFS e EP. Na análise por EFS (Tabela 3.6, pág. 61), os óleos A, C e F apresentam distribuição isomérica predominante da mistura de compostos 2,4-dimetilfenol+3-Etilfenol e, uma abundância relativa semelhante para os isômeros 2,5-dimetilfenol e 2,3-dimetilfenol. O isômero, 2-etilfenol apresenta uma abundância relativa semelhante nos óleos A e F e, maior para o óleo C. O óleo G apresenta uma abundância relativa baixa para todos os compostos dimetilfenóis quando comparados aos demais óleos.

Tabela 3.5 - Compostos fenólicos identificados nos óleos A, C, F e G.

Composto Estruturas TR* Composto Estruturas TR*

Fenol 27,30 4- Etilfenol 42,56

o-Cresol 33,11 2,3- Dimetilfenol 44,78

m-Cresol 34,06 3,4- Dimetilfenol 45,96

p-Cresol 34,73 2-Isopropilfenol 41,22

2-Etilfenol 30,00 2-n-Propilfenol 43,06

2,5-Dimetilfenol 39,05 3- Isopropilfenol 43,26

2,4-Dimetilfenol 40,00 4- Isopropilfenol 44,78

3-Etilfenol 40,00 2,4,6-Trimetilfenol 46,88

3,5- Dimetilfenol 40,52 2,3,5- Trimetilfenol 48,27

2,6- Dimetilfenol 41,64 2,3,6- Trimetilfenol 49,94

*TR = Tempo de Retenção.

Na análise por EP (Tabela 3.7, pág. 62), os óleos A, C, F e G contém uma mistura de alquilfenóis-C2 com uma distribuição isomérica predominante dos compostos 2,4-dimetilfenol+3-Etilfenol. Os isômeros 2-etilfenol e 2,3-dimetilfenol apresentam uma abundância relativa semelhante nos óleos A, e F. No óleo C os isômeros 2-etilfenol e 2,5-dimetilfenol apresentam uma abundância relativa semelhante entre si enquanto que o isômero 2,3-dimetilfenol apresenta uma abundância relativa levemente maior.

As diferenças observadas nas quantidades dos alquilfenóis em uma mesma amostra, obtida por EFS e EP, são devido em parte à quantidade de óleo utilizado em cada análise (EFS = 80 mg e EP = 200 mg). Porém, as relações entre os isômeros em um mesmo óleo diferem, na análise por EP, devido em parte, aos diferentes coeficientes de partição dos isômeros, na mistura metanol/água (9:1) utilizada. As Tabelas 3.6 (pág. 61) e 3.7 (pág. 62) ilustram essas diferenças nas concentrações dos alquilfenóis nas diferentes metodologias de extração.

Tabela 3.6 - Distribuição e concentração (g/g de óleo) dos compostos alquilfenóis-C2 por EFS nos óleos A, C, F e G.

Tabela 3.7 - Distribuição e concentração (g/g de óleo) dos compostos alquilfenóis-C2 por EP nos óleos A, C, F e G.

O RIC m/z 166 e m/z 180 (Figura 1.16) nos óleos FU e CM apresentam respectivamente a mesma distribuição para o fenol e cresóis. Os óleos diferem entre si na abundância relativa dos isômeros o-, m- e p-cresol em um mesmo óleo. No óleo CM os isômeros m-cresol e p-cresol apresentam basicamente a mesma proporção relativa. No óleo FU o p-cresol apresenta abundância relativa significativamente maior do que o m-cresol (Figura 1.16).

Figura 3.16 RIC m/z 166 e m/z 180 para os alquilfenóis obtidos por EFS nos óleos FU e CM.

Os dimetilfenóis (DMF) e trimetilfenóis (TMF) identificados pelo RIC m/z 194 e m/z 208 respectivamente (Figura 1.17) estão presentes em quantidades detectáveis no óleo FU e ausentes no óleo CM. Estes dois óleos pertencem a

diferentes campos, Cidade de São Miguel dos Campos (CM) e Furado (FU), localizados no estado de Alagoas. Algumas diferenças entre estes óleos foram também observadas na fração dos Hidrocarbonetos Saturados (HS), por exemplo, na classe dos n-alcanos e esteranos. A concentração dos alquilfenóis descritos acima para os óleos FU e CM, encontra-se em fase de determinação.

Figura 3.17 RIC m/z 194 e m/z 208 para os alquilfenóis obtidos por EFS nos óleos FU e CM.

Conclusões

 Os óleos A, C, F, G e FU da bacia Sergipe-Alagoas, são ricos em alquilfenóis.

Foram identificados por CG/EM nos óleos estudados compostos pertencentes às classes: fenol, metilfenol, dimetilfenol e trimetilfenol. O óleo CM não apresentou compostos DMF e TMF.

 Na extração por fase sólida, EFS, os isômeros 2,4-DMF+3-EF foram os constituintes principais nos óleos A, C e F com diferenças na proporção relativa em cada óleo. Na extração por partição, EP, os isômeros 2,4-DMF+3-EF estão presentes em todos os óleos estudados com maior abundância no óleo C.

 Os dois métodos de análise apresentaram diferenças nas proporções relativa dos alquilfenóis em uma mesma amostra, principalmente na relação entre os isômeros predominantes, 2-etilfenol e 2,4-dimetilfenol+3-Etilfenol. A extração por fase sólida, EFS, representa melhor a composição dos alquilfenóis nos óleos.