Compostos fenólicos totais

A determinação dos compostos fenólicos totais foi feita de acordo com o método de Singleton e Rossi (1965) modificado por Georgé et al. (2005) utilizando o reagente de Folin-

Ciocalteu (Sigma Aldrich®, Alemanha). A extração das amostras foi feita utilizando uma

solução de acetona P.A. 70% (v/v) para avolumar o balão âmbar de 25 mL, onde as amostras foram pesadas e extraídas sob agitação magnética por 30 minutos. O extrato foi filtrado utilizando papel de filtração rápida e diluído 1:10 em água.

O extrato bruto foi submetido a uma etapa de extração em fase sólida com cartucho de

Oasis® HLB (Waters Corporation, EUA). Este cartucho é preenchido por uma fase

estacionária de média polaridade (copolímero de poli-[divinilbenzenoN-vinilpirrolidona]), ideal para eluição dos compostos de alta solubilidade em água, como os açúcares redutores e vitamina C, e retenção dos compostos fenólicos no cartucho. Uma alíquota de 2,0 mL do extrato acetônico foi percolada pelo cartucho, seguido da adição de mais duas alíquotas de 2,0 mL de água destilada ao mesmo. Os filtrados foram recolhidos em uma proveta e homogeneizados.

O extrato, antes e após a eluição em cartucho, foi submetido à reação de Folin- Ciocalteau, que se iniciou com a transferência de 0,5 mL do extrato para um tubo de ensaio com adição de 2,5 mL de solução de Folin Ciocalteu previamente diluído em água (1:10;

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(v/v), sendo homogeneizado em vórtex. Após 2 minutos, adicionou-se 2,0 mL da solução de carbonato de sódio a 7,5% (m/v) e homogeneizou-se novamente em vórtex. Procedeu-se o aquecimento em banho a 50 °C por 15 minutos e, em seguida, o resfriamento em banho de gelo até temperatura ambiente. O branco foi feito utilizando acetona ao invés do extrato. A leitura de absorbância foi realizada em espectrofotômetro a 760 nm, zerado anteriormente com água destilada. O teor de compostos fenólicos totais foi a diferença entre os valores obtidos para o extrato antes e após a eluição em cartucho. Para quantificação, foi realizada

uma curva padrão com ácido gálico (Sigma-Aldrich®, Brasil) e os resultados foram expressos

em mg ácido gálico equivalente por 100 g de amostra. 4.3.8. Carotenoides totais e perfil

Os carotenoides totais foram extraídos utilizando a metodologia descrita por Rodriguez-Amaya (1999), a partir de maceração com acetona e celite. Em seguida, realizou-

se uma filtração a vácuo em funil com placa porosa sinterizada conectado a kitassato. O

sólido retido no funil foi retornado ao graal e procedida nova extração até que o sólido apresentasse ausência de coloração característica de carotenoide. Os pigmentos dissolvidos na acetona foram transferidos para um funil de separação contendo éter de petróleo. Em seguida, o extrato foi lavado sucessivamente com água destilada até que houvesse a eliminação da fase cetônica. Depois da lavagem, transferiu-se o extrato para um balão de 25 mL e avolumou-se com éter de petróleo. A absorbância deste extrato foi medida em espectrofotômetro em comprimento de onda de 453 nm.

Para a determinação do perfil de carotenoides, foi conduzida a análise cromatográfica segundo Pacheco et al. (2014). A partir do teor de carotenoides totais foi retirada uma alíquota de tal modo que a resposta cromatográfica estivesse dentro da faixa linear da curva analítica. O solvente foi removido sob fluxo de nitrogênio até a secura. Ao resíduo, foram adicionados 100 μL de acetona e o vial foi agitado em vórtex durante 10 segundos. Com auxílio de pipetador automático, a solução obtida foi transferida para vial com redutor de volume e realizou-se a análise cromatográfica.

Foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência Waters® W600 e detector de

arranjo de fotodiodos Waters® modelo 996, com varredura de 300 a 500 nm e quantificação

em 450 nm. Os compostos foram identificados por comparação do tempo de retenção e dos espectros de UV dos padrões. O método baseia-se na separação cromatográfica em coluna de fase reversa (C30, YMC Carotenoid S-3; 4,6 x 250 mm) a 33°C em modo de eluição

gradiente de metanol (Fase A) e éter metil-terc-butílico (Fase B) com fluxo de 0,8 mL.min-1,

volume de injeção de 15 μL e tempo de corrida de 28 min. 4.3.9. Composição centesimal

A composição centesimal foi realizada de acordo com a AOAC (2010). A determinação de umidade foi realizada pelo método gravimétrico (AOAC 925.09) e o resíduo mineral fixo ou cinzas foi determinado através da incineração da amostra em muflas a 550°C, de acordo com o método 923.03 para obtenção do teor total das substâncias inorgânicas presentes na amostra.

Para a determinação da proteína presente nas amostras, foi utilizado o método AOAC 2001.11. O teor proteico foi obtido pela determinação de nitrogênio pelo método de Kjeldahl, que se baseia na digestão da amostra com ácido sulfúrico concentrado até que o carbono e o hidrogênio sejam oxidados. O nitrogênio da proteína é reduzido e transformado em sulfato de amônia. Adiciona-se hidróxido de sódio e aquece-se para a liberação da amônia dentro de um

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volume conhecido de solução de ácido bórico. O borato de amônia formado é dosado com ácido sulfúrico 0,05 M. O teor de nitrogênio obtido é multiplicado por um fator específico (F = 6,38) para se obter o teor de proteínas.

Os lipídeos foram quantificados por extração em Soxhlet, com solvente orgânico éter de petróleo. A remoção do solvente foi feita por evaporação e a análise realizada de acordo com o método AOCS 5-04. A determinação de fibra alimentar total foi realizada por método enzimático-gravimétrico (AOAC 991.43). O teor de carboidratos totais foi calculado por diferença, excluindo-se do total os teores dos demais componentes (proteína, umidade, fibra alimentar, cinzas e lipídeos).

O valor energético foi calculado utilizando os teores, em gramas (g), de carboidratos, lipídeos e proteínas das amostras e considerando-se como fatores de conversão para carboidratos e proteínas 4 kcal/g e para os lipídeos 9 kcal/g (BRASIL, 2003), por meio da equação abaixo:

𝑉𝐸 = 4. 𝐶 + 4. 𝑃 + 9. 𝐿 Onde:

VE = valor energético (kcal) C = carboidratos (g)

P = proteínas (g) L = lipídeos (g) 4.3.10. Minerais

Os minerais foram determinados segundo método 999.10 da AOAC (2010), e quantificados pelo método 990.08 AOAC (2010).