Comprometimento de lisossomos e autofagia

Detecção de autofagia pela estratégia AAU in vitro

Para se mensurar autofagia empregou-se a estratégia de detecção de vacúolos autofágicos pela variável AAU (Arbritrary Autophagic Units) [154]. Sumariamente, essa estratégia baseia-se na marcação de vacúolos autofágicos pelo corante lisossomotrópico vermelho neutro (NR), usando-se o ensaio NRU. À medida em que se aumentava a concentração de cloroquina (CQ), uma droga indutora de autofagia, aumentava-se o acúmulo de vacúolos autofágicos sugestivos de autofagia (Rho = 0,9 p-valor <0,00001). Esse aumento de AAU se correlaciona inversamente com a sobrevida celular dada por CVS e MTT, indicando que CQ induz morte por autofagia [154].

Segundo essa abordagem, após a indução de autofagia há um acúmulo de NR em autolissosomos ou vacúolos autofágicos tardios em comparação ao controle não-tratado, onde se tem em maior frequência de lisossomos viáveis. Assim, em decorrência da maior incorporação e retenção do NR em vacúolos autofágicos lisosomotrópicos, há uma superestimação da taxa de sobrevida celular. Ao se normalizar essa taxa pela média das taxas de sobrevida celular estimadas pelos ensaios CVS e MTT, tem-se a variável AAU que se correlaciona significativamente e linearmente com morte celular autofágica.

Esta abordagem propõe identificar o acúmulo de NR por vacúolos autofágicos ácidos tardios (autolisossomas), os quais representam a fusão entre o autofagossoma e lisossoma na etapa final do processo autofágico [154]. As mesmas condições experimentais citadas no tópico de viabilidade celular foram utilizadas para o cálculo de AAU. Após experimentos de AAU,

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células HaCaT e J774 foram irradiadas sob luz UV-A e o experimento de microscopia foi realizado utilizando o laranjado de acridina (AO) usualmente empregado como corante vital e para se avaliar o acúmulo de vacúolos ácidos indicativos de morte celular autofágica.

As células HaCaT e J774 foram plaqueadas (3X104 _{células/mL) em}

placas de 6 poços sobre lamínula por 24 horas. As células foram lavadas e irradiadas em PBS segundo a irradiação sob luz UV-A a diferentes doses (J/cm2). Após 24 horas, as células foram incubadas por 10 minutos em solução de AO a 1 µg/mL. As lâminas foram preparadas em PBS e observadas sob microscópio epifluorescente invertido Axiovert 200 (Carl Zeiss, Alemanha) equipado com uma objetiva 40X (C-APOCHROMAT 40X/1.20 Corr M27 Zeiss™). A fluorescência do marcador AO foi detectada usando-se o filtro que promove excitação a 450-490 nm com emissão long pass (LP) de 515 nm. As imagens foram editadas e avaliadas usando-se o software Image J (National Institutes of Health, Bethesda).

Análise de autofagia por imunofluorescência

As células HaCaT foram plaqueadas em placas de 6 poços (2x105_{células/mL), contendo uma lamínula em cada poço, e após 24h as}

células foram irradiadas sob luz UV-A. Posteriormente as células foram lavadas em PBS e fixadas em formaldeído 4 % (m/v) por 15 minutos a temperatura ambiente. Após consecutivas lavagens em PBS com intervalos de 5 minutos, bloqueou-se as células em solução de PBS contendo soro albumina bovina (BSA) 5% (m/v) e Triton X-100 0,3% (v/v), por 1 hora a temperatura ambiente. Após bloqueio as células foram incubadas com anticorpo primário LC3-II (rabbit monoclonal anti-LC3B, Cell Signaling Technology, 3868S) diluído 1:200 em

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PBS contendo 1.0 % (m/v) de BSA (Sigma, A4161) e Triton X-100 (Sigma, X100) 0.3% (v/v) overnight a 4°C. Após lavagem, as células foram incubadas com anticorpo secundário (Alexa 488-goat fluorochrome-conjugated anti-rabbit IgG (H+L), Molecular Probes, A-11008) diluído a 1:500 em solução PBS1x contendo 1.0 % (m/v) de BSA (Sigma, A4161) e Triton X-100 (Sigma, X100) por 2 horas. Lamínulas foram montadas em lâminas de microscópio utilizando os meios de montagem Prolong-DAPI (Molecular Probes, P36935). As imagens foram obtidas por microscopia, usando-se o microscópio confocal Axiovert 200 (Zeiss LSM 510™, Alemanha) equipado com objetiva de 63X (Plan- APOCHROMAT 63X/1.40 DIC M27 Zeiss™). As imagens foram editadas no software Image J (National Institutes of Health, Bethesda). Os filtros de fluorescência foram utilizados para visualizar os núcleos-DAPI (excitação 364 nm / emissão 475nm) e Alexa 488 (excitação 488 nm/emissão 543 nm).

Análise de mitofagia por imunofluorescência de COXIV e LC3-II

Para se avaliar mitofagia, realizou-se o ensaio de imunofluorescência colocalizada para as proteínas de marcação de autofagossoma, LC3-II, e de marcação mitocondrial, COXIV, usando-se microscopia confocal. Para isso, as células HaCaT foram plaqueadas em placas de 6 poços (2x105_{células/mL),}

contendo uma lamínula em cada poço, e após 24h as células foram irradiadas sob luz UV-A. A seguir, as células aderidas em lamínulas foram lavadas em PBS e, em seguida, fixadas em solução tamponada de formaldeído a 4% (m/v) por 15 minutos à temperatura ambiente. Após fixação, as células foram lavadas três vezes com PBS gelado, em intervalos de 5 minutos. Após o bloqueio por 1 hora à temperatura ambiente em solução de PBS contendo Triton X-100 a 0,3% (v/v) e Albumina de Soro Bovino 5% (m/v), incubaram-se as lamínulas 12

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horas a 4C em presença dos anticorpos primários monoclonais de coelho anti- LC3-II (rabbit monoclonal anti-LC3B, Cell Signaling Technology, 3868S) e de camundongo anti-COXIV (Complex IV subunit IV monoclonal antibody, Life Technology, A21347), ambos diluídos 1:200 em PBS 1x contendo 1% (m/v) de Albumina de Soro Bovino e Triton X-100 a 0,3% (v/v).

Após o período de incubação do anticorpo primário, lavaram-se três vezes as lamínulas em PBS, seguido de incubação em PBS acrescida de Triton X-100 a 0,3% (v/v) contendo anticorpos secundário anti-IgG de coelho conjugado com Alexa-488 e anti-IgG de camundongo conjugado com Alexa- 633 ambos diluídos 1:500. Finalmente, após três lavagens consecutivas em PBS, com intervalos de 5 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz, montaram-se as lamínulas com Prolong-DAPI para detecção das imagens em microscópio confocal. Os filtros de excitação e emissão de fluorescência utilizados foram os seguintes: para visualizar o marcador nuclear DAPI, 362 nm/475 nm (emissão na cor azul); Alexa 488, 488 nm/520 nm (emissão na cor verde) e Alexa 633, 547 nm/630 nm (emissão na cor vermelha). As imagens foram obtidas como descrito anteriormente.

Quantificação da autofluorescência de autofagolisossomos

As células HaCaT foram plaqueadas em placas de 6 poços (2x105_{/mL) e}

após 24 horas, um grupo de células foi irradiado sob luz UV-A (6J/cm2) depois de 90 minutos de incubação com Tarf-Me (100µg/mL). Outro grupo celular foi apenas irradiado com luz UV-A (18J/cm2_{). Após 24 e 48 horas de incubação,}

os grupos celulares foram submetidas à detecção da autofluorescência da lipofuscina por citometria de fluxo (exc 488 nm, e 630nm).

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Fotossensibilização da lipofuscina no autofagolisossomo

O ensaio MTT foi utilizado para avaliar se células HaCaT UV-A foto- excitadas produziam lipofuscina, e se após irradiação sob a luz visível a viabilidade estaria comprometida. Para isso, irradiaram-se células HaCaT na dose UV-A de 12J/cm2, e após 48 horas de produção da lipofuscina, as células foram submetidas à irradiação sob luz visível a 36J/cm2_{. A seguir, o ensaio de}

MTT foi realizado imediatamente, conforme já descrito.