Concentração

O objectivo da medição da concentração do ejaculado é determinar o número de espermatozóides por ml de sémen puro de modo a gastar o mínimo de sémen possível. Após a determinação do volume e da concentração é possível calcular o factor de diluição do sémen (Barril et al. , 1993; Sousa, 2000). A concentração espermática varia

geralmente entre 2 e 10 x 109 espermatozóides por ml de sémen ejaculado. Segundo Gonçalves et al. (2001), o valor normal encontra-se em torno dos 3 biliões/ml de sémen. Mas segundo Evans e Maxwell, 1987, o sémen de bode de boa qualidade contém 2,5 a 5 x 109 espermatozóides/ml. Existem várias formas de medir a concentração: visualização directa da consistência do ejaculado, contagem exacta com um hemocitómetro e medida da densidade óptima através de um espectrofotómetro, podendo ainda ser utilizado um contador ou electrónico de partículas (Coulter).

2.8.2.2.1. Visualização Directa da Consistência do Ejaculado

A apreciação visual directa da concentração espermática (Fig. 5) é uma das técnicas utilizadas por vários centros de inseminação. Esta prática nem sempre é recomendada uma vez que a apreciação é subjectiva.

2.8.2.2.2. Contagem exacta com um Hemocitómetro

A contagem exacta do número de espermatozóides através de hemocitómetro é o método mais preciso para determinar a concentração, se efectuado com rigor. O principio desta medição é a contagem do número exacto de células espermáticas presentes num determinado volume de uma solução de diluição conhecida. A maioria dos hemocitómetros é composta por duas grelhas. Cada uma é dividida em 16 quadrados maiores que se subdividem em outros 16 quadrados mais pequenos (Fig. 6) com uma área de 1/400 mm2. A altura (distância) entre a lâmina e a lamela tem um valor constante de 1/10 mm e o volume de 1/4000 mm3 em cada quadrado pequeno (Baril et al., 1993).

Para se proceder à avaliação do sémen, este deve ser diluído numa solução espermicida, por exemplo uma solução salina a 3% ou em soro fisiológico formilado (Sousa, 2000). A diluição para ser precisa deve conter 0,01 ml de sémen puro misturado em 4 ml de solução formilada salina (0,9% de cloreto de sódio e 0,1% de formaldeído em água destilada), para homogeneizar a solução. A preparação da câmara de Neubauer deve ser efectuada com o auxílio de uma pipeta. Para fixar melhor a lamela à lâmina, deve colocar-se uma gota de água em cada uma das laterais da lamela. A pipeta, também, serve para colocar uma gota do sémen diluído, sem bolhas de ar, no bordo do hemocitómetro, entre a lâmina e a lamela. Assim, a gota espalhar-se por capilaridade na câmara de Neubauer. De seguida deixa-se repousar a placa para que haja sedimentação dos espermatozóides no fundo da lâmina (Baril et al., 1993). Por fim, coloca-se o hemocitómetro, cuidadosamente, no microscópio. Este deve conter um mecanismo de precisão que permita a visualização em duas direcções e contraste de fase.

No microscópio de contraste de fase, deve iniciar-se a observação a uma potência baixa (40x ou 100x) de modo a detectar a grade de contagem, passando-se posteriormente para uma ampliação mais elevada (400x) (Baril et al., 1993; Maia,

Figura 6 -´Grelha de Contagem do Hemocitómetro

2010). A contagem deve ser efectuada sobre o 5 quadrados maiores, numa linha diagonal. Apenas se devem contar os espermatozóides que têm as cabeças dentro dos quadrados grandes, sendo assim eliminados os que apresentarem as cabeças sobre a linha do quadrado no sentido interior exterior (Sousa, 2000). A concentração espermática calcula-se pela soma da contagem diagonal dos 5quadrados maiores multiplicando por 50 x 106 spz/ml. Esta técnica é muito precisa para determinação da concentração espermática. No entanto, requer bastante tempo e paciência, e não deve ser efectuada como método de rotina por um centro de inseminação artificial (Baril et al., 1993).

2.8.2.2.3. Densidade Óptima através de um Espectrofotómetro

Existem vários modelos de colorímetros disponíveis (Evans e Maxwell, 1987), no entanto o método mais rápido e eficaz para determinar a concentração espermática é a utilização do espectofotómetro. Esta técnica baseia-se na medição da densidade óptica, a um comprimento de onda de 550 namómetros, de uma solução salina contendo espermatozóides, com uma amostra "branca" sem espermatozóides. Se esta técnica for utilizada de forma rotineira, é necessário obter uma curva de calibração utilizando 20 a 50 amostras de concentrações diferentes de espermatozóides, a partir da contagem do hemocitómetro (Baril et al., 1993).

A correlação e o declive da linha de regressão são calculados entre a densidade óptica da amostra (x) e a sua concentração espermática (y). Ou seja, quanto maior a densidade espermática menor o feixe de luz transmitido pela amostra (Baril et al., 1993; Sousa, 2000). O coeficiente de correlação deve ser superior a 0,9 e o declive próximo de 1. Deste modo, um diagrama, ou a mesma fórmula podem ser utilizadas como método de rotina.

Nos carneiros o sémen diluído a uma taxa normal, apresenta uma relação inversa entre a quantidade de luz transmitida e o número de espermatozóides da amostra. No entanto, para os bodes a mesma situação não ocorre devido à coloração mais amarelada do sémen devido ao plasma seminal que interfere na transmissão da luz (Evans e Maxwell, 1987). O colorímetro deve ser calibrado com 10 a 15 contagens efectuadas pelo hemocitómetro, de modo a obter uma curva de calibração. Para a calibração, deverão ser utilizadas várias amostras de sémen de diferentes concentrações.. A precisão do colorímetro deve ser verificada ao longo do tempo através de comparações com as contagens do hemocitómetro. O sémen diluído 100x com uma solução salina de 0.9% possibilita uma leitura na gama mais sensível do colorímetro.