Concentração

A fração PCB mono-orto foi concentrada em Turbo Vap até cerca de 0,5 mL, à temperatura de 40 ± 4 ºC e pressão 7 bar ou 12 psi. Foram adicionados 100 ± 1 µL de padrão de seringa. As paredes do tubo foram lavadas com 5 mL de hexano e homogeneizadas em vortex. Uma nova concentração foi feita, em TurboVap, até 0,5mL, sendo transferidos 200 µL do extrato purificado para o insert e o vial foi fechado.

70 A fração dioxinas, furanos e PCB não-orto foi concentrada no Turbo Vap até cerca de 0,5 mL, à temperatura de 40 ± 4 ºC e pressão 7 bar ou 12 psi, os quais foram transferidos, quantitativamente, para o insert previamente inserido no vial. Em seguida, foi realizada evaporação suave no bloco aquecedor, à temperatura de 40 ± 4 ºC, até quase secura. Foram adicionados 20 ± 1 µL de padrão de seringa, homogeneizados em vórtex e o vial foi fechado.

4.6.7. Determinação

A detecção e quantificação foram realizadas por CG-EMAR. O EM foi operado no modo impacto de elétrons (EI), com ionização positiva. A coluna para o CG foi uma HP-5 MS (60 m x 25 mm x 0,25 µm). As condições do equipamento utilizadas foram:

Fração PCB mono-orto:

 Rampa de temperatura do forno: temperatura inicial de 140°C por 4 min, seguido de taxa de aquecimento de 8 °C/min até 220 °C, taxa de aquecimento de 1,4 °C/min até 243 °C, taxa de aquecimento de 2,4 °C/min até 260 °C por 5 min, e taxa de aquecimento de 20 °C/min até 310 °C.

 Fluxo de gás hélio de 1 mL/min.  Temperatura do injetor 280 °C.

 Temperatura do inlet, capilares 1 e 2, e re-entrant 310 °C (opcionalmente, septo 160 °C).

 Tempo de corrida de 45 min.  Modo de injeção splitless.  Volume de injeção 2 µL.

71  Rampa de temperatura do forno: temperatura inicial de140°C por 4 min, taxa de aquecimento de 8 °C/min até 220 °C, taxa de aquecimento de1,4 °C/min até 260 °C,taxa de aquecimento de 7 °C/min até 285 °C, por 6 min, e taxa de aquecimento de 25 °C/min até 315 °C.

 Fluxo de gás hélio de 1 mL/min.  Temperatura do injetor de280 °C.

 Temperaturas do inlet, capilares 1 e 2, e re-entrant310 °C (opcionalmente, septo 160 °C).

 Tempo de corrida de 53 min.  Modo de injeção splitless.  Volume de injeção de2 µL.

5. PRODUÇÃO DO MATERIAL

5.1. Procedimento piloto

No experimento piloto foram investigadas as melhores condições para a incorporação do padrão nativo na amostra de filé de tilápia, sendo avaliado: i) a forma de apresentação do padrão de dioxinas a ser incorporado ao filé processado, padrão solubilizado em solvente ou em óleo de peixe; ii) a possibilidade de adição do padrão em uma alíquota da amostra com posterior incorporação ao restante do material liofilizado, visando a minimização da quantidade de material contaminado a ser manipulado.

A concentração teórica escolhida foi estabelecida levando-se em consideração o limite de quantificação do método utilizado para a avaliação do material e a proximidade com a TEQ regulamentada para dioxinas, furanos e dl-PCB em pescado. Sendo assim, teores teóricos de 2pg/g de peixe para tetras PCDD e PCDF; 10 pg/g de peixe para pentas, hexas e heptas PCDD/Fs; 20 pg/g de peixe

72 para OCDD e OCDF; 75 pg/g de peixe para PCB não-orto e 500 pg/g de peixe para PCB mono-orto foram escolhidos para a contaminação do material no procedimento piloto.

Primeiramente, 500,00 g das amostras de filé de tilápia foram retirados do congelador e mantidos a temperatura ambiente (19 a 25 o_{C) por 20 min. Em seguida,}

os filés foram processados em homogeneizador tipo moedor com lâminas, por cerca de 30 min, até obtenção de uma pasta. A amostra processada foi dividida em dois sublotes de 250,00 g. Foram retirados 62,50 g de amostra de cada sublote. A uma das porções foram adicionados 52,5 ± 1 µL da solução padrão intermediária de dioxinas e furanos, de 790 ± 1 µL da solução padrão de uso de PCB não-orto e 131,5 ± 1 µL da solução padrão intermediária de PCB mono-orto, preparadas em nonano. A outra porção foi adicionada dos 974 ± 1 µL da solução padrão intermediária preparada em óleo de peixe. Os padrões foram incorporados às alíquotas por homogeneização em turrax, durante 10 min. As alíquotas contaminadas e respectivas porções restantes de cada sublote foram colocadas em bandejas de liofilizador e congeladas para liofilização. A liofilização ocorreu à temperatura e pressão máxima de - 40 ºC e 10-1 torr, até obtenção de massa constante. O tempo de liofilização foi de aproximadamente 36 h. Cada sublote liofilizado, foi, então, homogeneizado manualmente em gral e peneirado para obtenção de partículas homogêneas, em um agitador de peneiras com conjunto de peneiras nas granulometrias de 1 mm, 500 µm e 250 µm, por cerca de 15 min por batelada, repetindo-se o procedimento se necessário. Após o peneiramento de todos os sublotes, as alíquotas contaminadas foram adicionadas ao sublote não contaminado homogeneizando em um misturador Drum por 12 h. Finalmente, foi feito o acondicionamento em quatro frascos de vidro âmbar de 10 g, com tampa de rosca.

Foram tomados três materiais, de cada sublote, os quais foram analisados, pelo método descrito no item 4.6, em duplicata, para avaliação da homogeneidade, totalizando 12 ensaios (Figura 9). Além da homogeneidade, foram estimadas as

73 recuperações médias de cada material, visando avaliar as perdas no processo de produção.

Figura 9. Fluxograma do piloto para avaliar a incorporação do padrão.

5.2. Preparo do material

As amostras de tilápia (7331,6 g) foram homogeneizadas e preparadas conforme a condição otimizada na etapa piloto, sendo tomada uma alíquota proporcional (1,4 kg) para a incorporação do padrão de dioxinas. O produto

Amostra filé de tilápia congelada

(500 g) _{Descongelamento} (20 min sob temperatura

ambiente) Processamento

(moedor com lâminas por 30 min) Filé processado (250 g) Filé processado (187,5 g) Homogeneização

(Turrax por 15 min) Homogeneização manual Filé processado (62,5 g) Congelamento / Liofilização (36 h) Congelamento / Liofilização (36 h) Homogeneização manual Incorporação do padrão em nonano Acondicionamento em frasco âmbar análise

em duplicata Mistura e homogeneização (misturador Drum por 12 h) Peneiramento (agitador de peneiras 1 mm, 500 µm e 250 µm por 15 min) Peneiramento (agitador de peneiras 1 mm, 500 µm e 250 µm por 15 min) Filé processado (250 g) Filé processado (187,5 g) Homogeneização

(Turrax por 15 min) Homogeneização manual Filé processado (62,5 g) Congelamento / Liofilização (36 h) Congelamento / Liofilização (36 h) Homogeneização manual Incorporação do padrão em óleo de peixe Acondicionamento em frasco âmbar análise

em duplicata Mistura e homogeneização (misturador Drum por 12 h) Peneiramento (agitador de peneiras 1 mm, 500 µm e 250 µm por 15 min) Peneiramento (agitador de peneiras 1 mm, 500 µm e 250 µm por 15 min)

74 liofilizado e peneirado foi acondicionado em 138 frascos de vidro âmbar de 10 g e armazenados sob refrigeração (2 a 8 oC) (Figura 10).

Figura 10. Fluxograma de preparo do material de referência (MR).

5.3. Avaliação da homogeneidade

Dez unidades do material preparado foram tomadas, aleatoriamente, e analisadas em duplicata, pelo método descrito no item 4.6 (Figura 11), totalizando 20ensaios. Para estimativa da incerteza padrão devida à homogeneidade do material, para cada um dos 29 mensurandos, aplicou-se ANOVA (ABNT, 2012).

Os dados também foram analisados segundo os critérios estabelecidos na norma ISO 13528:2005 (ISO, 2005) e IUPAC (THOMPSON et al., 2006), visando avaliar também a adequação do material preparado para a avaliação de

Amostra filé de tilápia (7,33 kg) Preparo nas condições otimizadas Material liofilizado (1,38 kg) Acondicionamento (138 frascos de vidro âmbar

de 10 g)

Armazenamento sob refrigeração

75 desempenho de laboratórios por meio de EP. Nestes casos, σp o desvio padrão do ensaio de proficiência foi estimado pelo modelo de Horwitz (1982).

Figura 11. Delineamento para o teste de homogeneidade do material produzido.