O ensaio de viabilidade celular pela redução do MTT mostrou que as células da linhagem LLC-PK1 são sensíveis aos efeitos da cisplatina, apresentando diminuição da viabilidade celular mesmo em baixas concentrações. No entanto, não houve alteração da expressão dos genes analisados quando as células foram expostas às concentrações de 1 µM e 6 µM de cisplatina. É necessário que mais estudos sejam realizados para compreender como baixas concentrações de cisplatina afetaram o crescimento celular sem indução de aumento da expressão dos genes analisados na linhagem celular LLC-PK1.
A análise de expressão gênica mostrou aumento relativo de expressão para
HAVCR1 (KIM-1), BAX, CASP9, CASP3 e ICAM-1, quando as células foram
expostas a 15 µM de cisplatina. Esses resultados fornecem evidências de que esses genes são potenciais biomarcadores precoces para detecção de lesão renal, sendo necessários mais estudos para confirmar a robustez de previsibilidade dos mesmos. O aumento de expressão dos genes relacionados à apoptose, mais especificamente
BAX e CASP9, confirmam que um dos mecanismos de nefrotoxicidade induzida por
cisplatina é a apoptose via mitocondrial.
Trabalhos futuros são necessários para a validação de biomarcadores genômicos e da linhagem celular LLC-PK1, no entanto, nossos resultados indicam que os genes estudados são adequados para avaliação de nefrotoxicidade, auxiliando no desenvolvimento de drogas mais seguras.
REFERÊNCIAS
ALVES, M. Ativistas resgatam cães de laboratório de testes em São Roque (SP).
Folha de S. Paulo, São Paulo, 18 out. 2013. Disponível em: <http://www1.folha.uol.com.br/cotidiano/2013/10/1358477-ativistas-invadem-laborato rio-em-sao-roque.shtml>. Acesso em: 24 maio 2015.
ARAÚJO, G. L.; CAMPOS, M. A. A.; VALENTE, M. A. S.; SILVA, S. C. T.; FRANÇA, F. D.; CHAVES, M. M.; TAGLIATI, C. A. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 50, n. 1, p. 55-62, jan./mar. 2014.
BONES, V. C.; MOLENTO, C. F. M. Alternativas ao uso de animais de laboratório no Brasil. Veterinária em Foco, v. 10, n. 1, p. 103-112, jul./dez. 2012.
BONVENTRE, J. V. Kidney injury molecule-1: a translational journey. Transactions
of the American Clinical and Climatological Association, v. 125, p. 293-299,
2014.
BRASIL. Lei nº 11.794, de 08 de outubro de 2008. Regulamenta o inciso VII do § 1o do art. 225 da Constituição Federal, estabelecendo procedimentos para o uso científico de animais; revoga a Lei no 6.638, de 8 de maio de 1979; e dá outras providências. Diário Oficial da União, Brasília, DF, n.196, 09 out. 2008. Seção 1, p. 1.
CAZARIN, K. C. C.; CORRÊA, C. L.; ZAMBRONE, F. A. D. Redução, refinamento e substituição do uso de animais em estudos toxicológicos: uma abordagem atual.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 40, n. 3, p. 289-299, jul./set.
2004.
CHEN, M.; ZHANG, M.; BORLAK, J.; TONG, W. A decade of toxicogenômica research and its contribution to toxicological science. Toxicological Sciences, v. 130, n. 2, p. 217-228, jul. 2012, doi: 10.1093/toxsci/ksf223.
CONCEA. Resolução Normativa nº 18, de 24 de setembro de 2014. Reconhece métodos alternativos ao uso de animais em atividades de pesquisa no Brasil, nos termos da Resolução Normativa nº 17, de 03 de julho de 2014, e dá outras providências. Diário Oficial da União, Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação, Brasília, DF, n. 185, 25 set. 2014. Seção 1, p. 9.
DASARI, S.; TCHOUNWOU, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European Journal of Pharmacology, v. 740, p. 364-368, out. 2014, doi: 10.1016/j.ejphar.2014.07.025.
DENAMUR, S.; VAN BAMBEKE, F.; MINGEOT-LECLERCQ, M.-P.; TULKENS, P. M. Apoptosis induced by aminoglycosides in LLC-PK1 cells: comparative study of neomycin, gentamicin, amikacin, and isepamicin using electroporation.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 52, n. 6, p. 2236-2238, jun. 2008, doi:
EL-NAGA, R. N. Pre-treatment with cardamonin protects against cisplatin-induced nephrotoxicity in rats: impact on NOX-1, inflammation and apoptosis. Toxicology
and Applied Pharmacology, v. 274, n. 1, p. 87-95, jan. 2014, doi:
10.1016/j.taap.2013.10.031.
EUROPEAN COMMISSION. Seventh Report from the Commission to the
Council and the European Parliament on the Statistics on the Number of Animal used for Experimental and other Scientific Purposes in the Member States of the European Union, 2013. COM(2013) 859 final. Disponível em: <
http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/reports_en.htm>. Acesso em: 14 maio 2015.
FRANÇA, F. D.; FERREIRA, A. F.; LARA, R. C.; ROSSONI, J. V. Jr.; COSTA, D. C.; MORAES, K. C.; GOMES, D. A.; TAGLIATI, C. A.; CHAVES, M. M. Role of protein kinase A signaling pathway in cyclosporine nephrotoxicity. Toxicology Mechanisms
and Methods, v. 24, n. 6, p. 369-376, set. 2014, doi: 10.3109/15376516.2014.920447.
FUCHS, T. C.; HEWITT, P. Biomarkers for drug-induced renal damage and nephrotoxicity – an overview for applied toxicology. The AAPS Journal v. 13, n. 4, dez. 2011, doi: 10.1208/s12248-011-9301-x.
FUKASAWA, H.; FURUYA, R.; YASUDA, H.; YAMAMOTO, T.; HISHIDA, A.; KITAGAWA, M. Anti-cancer agent-induced nephrotoxicity. Anti-Cancer Agents in
Medicinal Chemistry, v. 14, n. 7, p. 921-927, set. 2014.
GANONG, W. F. Função renal e micção. In: ________. Fisiologia Médica. 22. ed. Porto Alegre: AMGH, 2010.
GARTNER, L. P.; HIATT, J. L. Sistema urinário. In: ________. Tratado de
Histologia em Cores. 3. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2007. p. 443-468.
GONZALEZ, V. M.; FUERTES, M. A.; ALONSO, C.; PEREZ, J. M. Is cisplatin- induced cell death always produced by apoptosis? Molecular Pharmaceuticals, v. 59, n. 4, p. 657-663, abr. 2001.
GOODSAID, F. M. Identification and measurement of genomic biomarkers of nephrotoxicity. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, v. 49, n. 3, p. 183-186, maio/jun. 2004, doi: 10.1016/j.vascn.2004.02.005.
GRIVICICH, I.; REGNER, A.; ROCHA, A. B. Morte celular por apoptose. Revista
Brasileira de Cancerologia, v. 53, n. 3, p. 335-343, jul./set. 2007.
HALL, J. E. Tratado de Fisiologia Médica. 12. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2011. HAN, W. K.; BAILLY, V.; ABICHANDANI, R.; THADHANI, R.; BONVENTRE, J. V. Kidney injury molecule-1 (KIM-1): a novel biomarker for human renal proximal tubule injury. Kidney International, v. 62, p. 237-244, mar. 2002, doi: 10.1046/j.1523- 1755.2002.00433.x.
HARTUNG, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of
Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 77, n. 3, p. 338-349, abr. 2011. doi:
10.1016/j.ejpb.2010.12.027
ICHIMURA, T.; BONVENTRE, J. V.; BAILLY, V.; WEI, H.; HESSION, C. A.; CATE, R. L.; SANICOLA, M. Kidney injury molecule-1 (KIM-1), a putative epithelial cell adhesion molecule containing a novel immunoglobulin domain, is up-regulated in renal cells after injury. The Journal of Biological Chemistry, v. 273, n. 7, p. 4135- 4142, fev. 1998.
ICHIMURA, T.; HUNG, C. C.; YANG, S. A.; STEVENS, J. L.; BONVENTRE, J. V. Kidney injury molecule-1: a tissue and urinary biomarker for nephrotoxicant-induced renal injury. American Journal Physiology Renal Physiology, v. 286, n.3, p. F552- F563, mar. 2004, doi: 10.1152/ajprenal.00285.2002.
ICHIMURA, T.; ASSELDONK, E. J. P.v.; HUMPHREYS, B. D.; GUNARATNAM, L.; DUFFIELD, J. S.; BONVENTRE, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells.
The Journal of Clinical Investigations, v. 118, n. 5, p. 1657-1668, maio 2008. Doi:
10.1172/JCI34487.
IMAMDI, R.; GRAAUW, M.; VAN DE WATER, B. Protein Kinase C mediates cisplatin-induced loss of adherens junctions followed by apoptosis of renal proximal tubular epithelial cells. The Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics, v. 311, n. 3, p. 892-903, dez. 2004, doi: 10.1124/jpet.104.072678.
KAPLAN, G.; TOTSUKA, A.; THOMPSON, P.; AKATSUKA, T.; MORISUGU, Y.; FEINSTONEL, S. M. Identification of a surface glycoprotein on African green monkey kidney cells as a receptor for hepatitis A virus. The EMBO Journal, v. 15, n. 16, p. 4282-4296, ago. 1996.
KARASAWA, T.; STEYGER, P. S. An integrated view of cisplatin-induced nephrotoxicity and ototoxicity. Toxicology Letters, v. 237, n. 3, p. 219-227, set. 2015, doi: 10.1016/j.toxlet.2015.06.012.
KAUSHAL, G. P.; KAUSHAL, V.; HONG, X.; SHAH, S. V. Role and regulation of activation of caspases in cisplatin induced injury to renal tubular epithelial cells.
Kidney International, v. 60, n. 5, p. 1726-1736, nov. 2001.
KELLY, K. J.; MEEHAN, S. M.; COLVIN, R. B. WILLIAMS JR, W. W.; BONVENTRE, J. V. Protection from toxicant-mediated renal injury in the rat with anti-CD54 antibody.
Kidney International, v. 56, n. 3, p. 922-931, set. 1999.
LACY, C. F.; ARMSTRONG, L. L.; GOLDMAN, M. P.; LANCE, L. L. Drug
information handbook. 11 ed. Ohio: Lexi-Comp Inc, 2003. 2029 p.
LAU, A. H. Apoptosis induced by cisplatin nephrotoxic injury. Kidney International, v. 56, n. 4, p. 1295-1298, out. 1999.
MILLER, R. P.; TADAGAVADI, R. K.; RAMESH, G.; REEVES, W. B. Mechanisms of cisplatin nephrotoxicity. Toxins, v. 2, p. 2490-2518, oct. 2010. doi: 10.3390/toxins2112490
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods, v. 65, n. 1, p. 55-63, dez. 1983. doi: 10.1016/0022-1759(83)90303-4.
NAUGHTON, C. A. Drug-induced nephrotoxicity. American Family Physician, v. 78, n. 6, p. 743-750, set. 2008.
NEVES, A. P.; VARGAS, M. D. Complexos de platina (II) na terapia do câncer.
Revista Virtual de Química, v. 3, n. 3, p. 196-209, set. 2011.
NORTH, M.; VULPE, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences, v. 11, n. 12, p. 4796- 4813, nov. 2010, doi: 10.3390/ijms11124796.
NOZAKI, Y.; KINOSHITA, K.; HINO, S.; YANO, T.; NIKI, K.; HIROOKA, Y.; KISHIMOTO, K.; FUNAUCHI, M.; MATSUMURA, I. Signaling Rho-kinase mediates inflammation and apoptosis in T cells and renal tubules in cisplatin nephrotoxicity.
American Journal of Physiology Renal Physiology, v. 308, n. 8, p. F899-F909,
abr. 2015, doi: 10.1152/ajprenal.00362.2014.
OH, G-S.; KIM, H-J.; SHEN, A.; LEE, S. B.; KHANDKA, D.; PANDIT, A.; SO, H-S. Cisplatin-induced kidney dysfunction and perspectives on improving treatment strategies. Electrolyte Bood Press, v. 12, n. 2 p. 55-65, dez. 2014, doi: 10.5049/EBP.2014.12.2.55.
PABLA, N; DONG, Z. Cisplatin nephrotoxicity: mechanisms and renoprotective strategies. Kidney International, v. 73, n. 9, p. 994-1007, maio 2008, doi: 10.1038/sj.ki.5002786.
PARK, M. S.; LEON, M.; DEVARAJAN, P. Cisplatin induces apoptosis in LLC-PK1 via activation of mitochondrial pathways. Journal of the American Society of
Nephrology, v. 13, n. 4, p. 858-865, abr. 2002.
PAZHAYATTIL, G. S.; SHIRALI, A. C. Drug-induced impairment of renal function.
International Journal of Nephrology and Renovascular Disease, v. 7, p. 457-468,
dez. 2014.
PERES, L. A. B.; CUNHA JÚNIOR, A. D. Nefrotoxicidade aguda da cisplatina: mecanismos moleculares. Jornal Brasileiro de Nefrologia, v. 35, n. 4, p. 332-340, out. 2013, doi: 10.5935/0101-2800.20130052.
PERES, C. M.; CURI, R. Como cultivar células. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005.
PROZIALECK, W. C.; EDWARDS, J. R. Cell adhesion molecules in chemically- induced injury. Pharmacology & Therapeutics, v. 114, n. 1, p. 74-93, abr. 2007, doi: 10.1016/j.pharmthera.2007.01.001.
RAMESH, G.; REEVES, W. B. TNFR2-mediated apoptosis and necrosis in cisplatin- induced acute renal failure. American Journal of Physiology-Renal Physiology, v. 285, n. 4, p. F610-F618, out. 2003, doi: 10.1152/aiprenal.00101.2003.
RENAMA. Laboratórios associados. Disponível em:
<http://renama.org.br/?page_id=59>. Acesso em: 21 ago. 2015.
RUSSEL, W.; BURCH, R. The principles of humane experimental technique. 1959. Disponível em: <http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc>. Acesso em: 11 mar. 2015.
SERVAIS, H.; ORTIZ, A.; DEVUYST, O.; DENAMUR, S.; TULKENS, P. M.; MINGEOT-LECLERCQ, M.-P. Renal cell apoptosis induced by nephrotoxic drugs: cellular and molecular mechanisms and potential approaches to modulation.
Apoptosis, v. 13, n. 1, p. 11-32, jan. 2008, doi: 10.1007/s10495-007-0151-z.
SPIELMANN, H. Animal use in the safety evaluation of chemicals: harmonization and emerging needs. ILAR Journal, v. 43, supl., p. S11-S17, 2002.
SPINDLER, P.; SJÖBERG, P.; KNUDSEN, L. E. First exposure in man: toxicological considerations. Pharmacology & Toxicology, v. 86, supl. I, p. 8-12, 2000.
STEPANENKO, A. A.; DMITRENKO, V. V. Pitfalls of the MTT assay: direct and off- target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene, ago. 2015, doi: 10.1016/j.gene.2015.08.009.
SUTER, L.; BABISS, L. E.; WHELLDON, E. B. Toxicogenomics in predictive toxicology in drug development. Chemistry & Biology, v. 11, p. 161-171, fev. 2004, doi: 10.1016/j.chembiol.2004.02.003.
TIONG, H. Y.; HUANG, P.; XIONG, S.; LI, Y.; VATHSALA, A.; ZINK, D. Drug-induced neprotoxicity: clinical impact and preclinical in vitro models. Molecular
Pharmaceutics, v. 11, n. 7, p. 1933-1948, jul. 2014.
TOWNSEND, D. M.; DENG, M.; ZHANG, L.; LAPUS, M. G.; HANIGAN, M. H. Metabolism of cisplatin to a nephrotoxin in proximal tubule cells. Journal of the
American Society of Nephrology, v. 14, n. 1, p. 1-10, jan. 2003, doi:
10.1097/01.ASN.0000042803.28024.92.
VAIDYA, V. S.; OZER, J. S.; DIETERLE, F.; COLLINGS, F. B.; RAMIREZ, V.; TROTH, S.; MUNIAPPA, N.; THUDIUM, D.; GERHOLD, D.; HOLDER, D. J.; BOBADILHA, N. A.; MARRER, E.; PERENTES, E.; CORDIER, A.; VONDERSCHER, J.; MAURER, G.; GOERING, P. L.; SISTARE, F. D.; BONVENTRE, J. V. Kidney injury molecule-1 outperforms traditional biomarkers of kidney injury in preclinical biomarker qualification studies. Nature Biotechnology, v. 28, n. 5, maio 2010, doi: 10.1038/nbt.1623.
VAN DE WATER, B.; GRAAUW, M.; LE DÉVÉDEC, S.; ALDERLIESTEN, M. Cellular stress responses and molecular mechanisms of nephrotoxicity. Toxicology Letters, v. 162, n. 1, p. 83-93, mar. 2006, doi: 10.1016/j.toxlet.2005.10.014.
VICKERS, A. E. M.; ROSE, K.; FISHER, R.; SAULNIER, M.; SAHOTA, P.; BENTLHEY, P. Kidney slices of human and rat to characterize cisplatin-induced injury on cellular pathways and morphology. Toxicology Pathology, v. 32, n. 5, p. 577-590, set./out. 2004, doi: 10.1080/01926230490508821.
WANG, E-J.; SNYDER, R. D.; FIELDEN, M. R.; SMITH, R. J.; GU, Y-Z. Validation of putative genomic biomarkers of nephrotoxicity in rats. Toxicology, v. 246, n. 2, p. 91-100, abr. 2008, doi: 10.1016/j.tox.2007.12.031.
WEI, Q.; DONG, G.; FRANKLIN, J.; DONG, Z. The pathological role of Bax in cisplatin nephrotoxicity. Kidney International, v. 72, n. 1, p. 53-62, jul. 2007, doi: 10.1038/sj.ki.5002256.
YANO, T.; ITOH, Y.; MATSUO, M.; KAWASHIRI, T.; EGASHIRA, N.; OISHI, R. Involvement of both tumor necrosis factor-α-induced necrosis and p53-mediated caspase-dependent apoptosis in nephrotoxicity of cisplatin. Apoptosis, v. 12, n. 10, p. 1901-1909, out. 2007, doi: 10.1007/s10495-007-0110-8.
APÊNDICE A – Estudo in vitro de potenciais biomarcadores de nefrotoxicidade por expressão gênica1
Resumo
A nefrotoxicidade induzida por fármacos é um importante fator limitante do uso de medicamentos. Durante os ensaios toxicológicos, a nefrotoxicidade é subestimada devido a falta de preditividade dos modelos in vivo utilizados atualmente. Os métodos alternativos in vitro podem levar ao desenvolvimento de medicamentos mais seguros, podendo ser utilizados tanto na triagem de novas moléculas quanto nos ensaios pré-clínicos. Considerando que os danos moleculares e celulares precedem as alterações histopatológicas, o estudo da expressão gênica induzida por medicamentos torna-se importante na busca de biomarcadores precoces. A cisplatina é um quimioterápico amplamente utilizado na prática médica que tem na nefrotoxicidade sua maior limitação. As principais células renais atingidas pela nefrotoxicidade induzida por cisplatina são as do túbulo proximal devido a diversos fatores. No presente estudo, células LLC-PK1 foram expostas a cisplatina por 48 horas e as concentrações de 1 µM, 6 µM e 15 µM foram escolhidas após o ensaio de MTT. A expressão de genes relacionados a nefrotoxicidade foi analisada através de PCR em tempo real nas células expostas às concentrações citadas. A diminuição da viabilidade celular observada nas concentrações de 1 µM e 6 µM não foi acompanhada de alteração na expressão dos genes estudados e necessitam de mais estudos para a compreensão de como a cisplatina afetou o crescimento celular. Os genes HAVCR1 (KIM-1), BAX, CASP9, CASP3 e ICAM-1 tiveram a expressão aumentada após exposição a 15 µM de cisplatina quando comparada a células não expostas. Nossos resultados sugerem que esses genes podem ser utilizados como biomarcadores in vitro de nefrotoxicidade, necessitando de mais estudos para validação dos mesmos.
Palavras-chave: nefrotoxicidade, biomarcadores, cisplatina, LLC-PK1.
__________________________
1Manuscrito
APÊNDICE A (continuação) 1. Introdução
O potencial nefrotóxico é frequentemente subestimado durante o desenvolvimento de novos fármacos (TIONG et al., 2014). Apenas 7% dos candidatos a fármacos falham devido a nefrotoxicidade, no entanto, cerca de 30% a 50% dos pacientes em unidades de terapia intensiva apresentam quadro de insuficiência renal aguda (FUCHS, HEWITT, 2011). Os modelos atuais para predição de nefrotoxicidade utilizam animais e marcadores clássicos, como creatinina e ureia, que são pouco sensíveis (VAIDYA et al., 2010).
O uso de biomarcadores de toxicidade pode melhorar significativamente o desenvolvimento de novas drogas, beneficiando o processo de descoberta de um novo fármaco desde a triagem de novas moléculas (GOODSAID, 2004). Assim, genes que consistentemente exibem alterações de expressão em resposta a efeitos tóxicos podem ser utilizados como marcadores para predizer potenciais efeitos adversos. Sistemas in vitro para avaliação de nefrotoxicidade são importantes ferramentas para compreensão de mecanismos de ação e para desenvolvimento de processos de triagem para predição precoce de nefrotoxicidade (FUCHS, HEWITT, 2011). O conceito de que os eventos moleculares precedem os eventos patológicos tem direcionado o desenvolvimento de ensaios toxicogenômicos rápidos para toxicidade que normalmente são realizados em ensaios de longo prazo em animais (CHEN et al., 2012).
Para identificação de potenciais biomarcadores de injúria renal é fundamental o estudo de nefrotoxicantes conhecidos, como a cisplatina. A cisplatina é um quimioterápico utilizado no tratamento de diversos tipos de câncer (MILLER et al., 2010; PAZHAYATTIL, SHIRALI, 2014), sendo a nefrotoxicidade um dos principais fatores limitantes do seu uso na prática clínica. Por serem mais acometidas pela nefrotoxicidade induzida por cisplatina, as células do túbulo proximal são as mais utilizadas para estudos de mecanismos (PABLA, DONG, 2008).
Neste estudo, células LLC-PK1 foram expostas a cisplatina e a expressão de diversos genes foi avaliada para identificação de potenciais biomarcadores precoces de nefrotoxicidade.
APÊNDICE A (continuação) 2. Material e Métodos
2.1 Linhagem celular e tratamento
Células LLC-PK1 (ATCC® CL-101™), células de túbulo proximal isoladas de rins de porco, foram adquiridas de American Type Culture Colection. As células foram mantidas em meio essencial mínimo (MEM; Gibco) com 4% de soro fetal bovino (Gibco) e solução antibiótica e antimicótica (penicilina, estreptomicina, anfotericina; Sigma) em estufa a 37 ºC, umidificada com atmosfera de 5% de CO2.
2.2 Ensaio de viabilidade celular pelo método de redução no MTT
Para o ensaio de MTT, as células foram semeadas em placas de 96 poços na concentração de 5,0 x 103 células por poço e expostas às concentrações de 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 15 µM de cisplatina (Sigma) por 48 horas. Após a exposição, o fármaco foi retirado e as células foram incubadas por 3 horas em estufa a 37 ºC, umidificada com atmosfera de 5% de CO2 com 0,5 mg/mL de MTT (3-[4,5- Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide; Sigma) em meio de cultura. Então, a solução foi retirada e foi adicionado 100 µL de dimetilsulfóxido (Synth) e procedeu-se a leitura de absorbância a 570 nm em espectrofotômetro (Molecular Devices VERSAmax). As células foram expostas em sextuplicata para cada concentração de cisplatina em três ensaios independentes.
2.3 Análise de expressão gênica por PCR em tempo real
As células foram semeadas em placas de 96 poços na concentração de 5,0 x 103 células por poço e expostas às concentrações de 0, 1, 6 e 15 µM de cisplatina por 48 horas e o RNA total foi extraído utilizando-se TRIzol (Ambion). O RNA foi convertido a cDNA utilizando kit illustra™ Ready-to-Go Beads™ (GE Healthcare) conforme instruções do fabricante, a partir de amostra contendo 300 ng/µL de RNA. A busca pelas sequências de mRNA codificadores de proteínas previamente associados a danos renais foi realizada nos bancos de dados do National Center for
Biotechnology Information (NCBI), os iniciadores foram obtidos através do programa PrimerBLAST (NCBI) e estão listados na Tabela 1.
A reação de PCR em tempo real foi preparada utilizando 5 µL de SYBR®Green Master Mix (Applied Biosystems), 200 nM de cada oligonucleotídeo
APÊNDICE A (continuação)
iniciador e 3 µL das amostras de cDNA diluídas 10 vezes. As reações de PCR foram efetuadas em equipamento StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems) em triplicata nas seguintes condições de amplificação: 50 ºC por dois minutos, 95 ºC por dez minutos seguidos de 40 ciclos a 95 ºC por quinze segundos e 60 ºC por um minuto. Os dados da curva de dissociação foram coletados no intervalo entre 60 ºC e 95 ºC. O método comparativo do ciclo limiar foi utilizado para análise de dados de acordo com a equação 2-ΔΔCt. Os dados estão apresentados como unidades de expressão relativa após normalização para o gene GAPDH.
Tabela 1 – Sequência de iniciadores utilizados nos ensaios de PCR em tempo real
Gene Descrição do Gene Acesso Sequência forward Sequência reverse
ANXA5 Annexin A5 XM_003129218 GTCGCTATGGCACAGGTTCT AGGATGCTCTCCTCGTCAGT
BAX BCL2-associated X protein XM_003127290 CCGAACTGATCAGGACCATC AAGATGGTCACCGTCCAACC
BCL-2 B-cell CLL/lymphoma 2 XM_003121700 CCTTGGATCCAGGAGAACGG AACCACCCCAGCTAGAGTCA
BCL2L1
(BCL-XL) BCL2-like 1 NM_214285 AGGGCATTCAGTGACCTGAC CCATCCCGGAAGAGTTCGTT
CASP3 Caspase 3, apoptosis-
related cysteine peptidase NM_214131 GACGGACAGTGGGACTGAAG TGGATGAACCAGGATCCGTC
CASP9 Caspase 9, apoptosis-
related cysteine peptidase XM_003127618 CTGCCAAGCAAATGGTCCAG CTGTGCCATAAACAGCCCCT
EXOC6 Exocyst complex
component 6 XM_003361565 TCGAAAAGCAACCCTTCCCA AGCTCCGGTGTAGTGACTCT
GAPDH Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase NM_001206359 GAAGGTCGGAGTGAACGGA GCCAGAGTTAAAAGCAGCCC HAVCR1 (KIM1)
Hepatitis A virus cellular
receptor 1 NM_001164736 TTGCTCCAACAACTGGTGTCT GCAGCACCTGTATGGACAGT
ICAM-1 Intercellular adhesion
molecule-1 NM_213816 ACTTATGTCCTGCCAGCCAC GTTCACAGAAACGGGTGTGC
VDAC1 Voltage-dependent anion
channel 1 NM_213960 GCCTGCTTCTCGGCTAAAGT CACCGGCGTTGACATTCTTG
2.4 Análise estatística
Todos os dados apresentados representam experimentos em triplicadas e estão expressos pela média ± desvio padrão. Os resultados foram analisados através do teste One-Way ANOVA com pós-teste de Tukey utilizando o programa
APÊNDICE A (continuação)
GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.), sendo consideradas significativas as análises com p<0,05.
3. Resultados
3.1 Avaliação da viabilidade celular.
A viabilidade das células LLC-PK1 após tratamento com cisplatina foi avaliada utilizando o método de redução do MTT. Através deste método, o efeito tóxico de determinada substância pode ser avaliado pela formação do subproduto formazan, que é derivado da metabolização do MTT por desidrogenases mitocondriais de células metabolicamente ativas.
Verificou-se que a linhagem celular analisada é sensível à toxicidade da cisplatina de maneira concentração-dependente, conforme a curva concentração- resposta (Figura 1). Após 48 h de exposição, houve diferença estatisticamente significativa (p<0,05) entre todas as concentrações testadas em relação ao grupo controle e, também, entre todas as concentrações, exceto 8 µM X 10 µM e 10 µM X 12 µM.
Tendo em vista as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) encontradas entre as concentrações analisadas, foram definidas as concentrações 1 µM, 6 µM e 15 µM para os estudos de expressão gênica.
3.2 Efeito do tratamento na expressão gênica.
As células foram expostas às concentrações selecionadas de cisplatina por 48 h, seguida da extração do RNA total, síntese de cDNA e PCR em tempo real. Os genes analisados foram identificados através de pesquisa bibliográfica, após avaliação em modelos in vitro e in vivo e que demonstraram expressão diferencial mediante tratamentos nefrotóxicos. O PCR em tempo real foi utilizado para mensurar o nível relativo de expressão gênica nas células LLC-PK1 e as alterações foram representadas em relação às células não expostas à cisplatina. Dentre os genes analisados, observou-se alteração na expressão de cinco deles. Os demais alvos apresentaram dois picos de amplificação na curva de dissociação durante o PCR em tempo real e, por isso, foram desconsiderados.
APÊNDICE A (continuação)
Figura 1 – Avaliação da metabolização doMTT.
__________________________
Curva concentração-resposta da linhagem celular renal LLC-PK1. As células foram expostas a concentrações crescentes de cisplatina por 48 horas. Ensaio realizado em sextuplicata em três experimentos independentes. Controle negativo (células não tratadas) foram consideradas com 100% de viabilidade celular. (* p<0,05, valores significativamente diferentes em relação ao grupo controle; **p<0,05, valores significativamente diferentes entre si).
A análise de expressão gênica demonstrou que houve aumento relativo dos alvos HAVCR1, BAX, CASP9, CASP3 e ICAM-1 quando comparados ao nível de expressão dos transcritos desses mesmos genes nas células não expostas ao fármaco. Os cinco genes citados apresentaram aumento estatisticamente significativo (p<0,05) na concentração 15 µM em relação ao grupo controle. No entanto, apesar da diminuição da viabilidade celular observada pelo método de redução do MTT, não houve diferença estatisticamente significativa nas concentrações de 1 µM e 6 µM em relação ao controle negativo (Figura 2).
4. Discussão
A linhagem de células LLC-PK1 é largamente utilizada para estudos de nefrotoxicidade. No entanto, existe grande discrepância na literatura entre os regimes de tratamento de cisplatina em trabalhos in vitro no que se refere a
APÊNDICE A (continuação)
concentração e tempo de exposição (KAUSHAL et al., 2001; PARK, LEON, DEVARAJAN, 2002; TOWNSEND et al., 2003; IMAMDI, GRAAUW, VAN DE WATER, 2004; YANO et al., 2007). Porém, baixas concentrações, como as utilizadas no presente estudo, não foram encontradas durante a pesquisa bibliográfica no banco de dados do PubMed quando a busca foi realizada cruzando