CONCLUSÃO

Sementes de mirtilo cvs. Briteblue e Climax tratadas previamente com 5 M de KOH por 5 minutos e germinadas sobre o mesmo substrato e submetidas à igual temperatura reduzem a porcentagem de germinação em relação às não tratadas.

Sementes de mirtilo de ambas as cultivares testadas alteram seu comportamento germinativo conforme a combinação das variáveis temperatura (10⁰C e 25⁰C) e substrato (SP e MS/2).

Sementes de mirtilo Vaccininium ashei Reade submetidas a tratamentos oriundos da combinação das variáveis: exposição ou não ao KOH, substratos (SP e

MS/2) e temperaturas (10⁰C e 25⁰C) demandam acima de 46 dias para a emissão da primeira plântula normal e apresentam germinação lenta, sendo que, após 6 meses do início do teste de germinação, a porcentagem de germinação não ultrapassa 40%.

O corte transversal possibilita avaliar de forma eficiente a viabilidade das sementes de mirtilo cv. Briteblue e Climax, pré-umedecidas em água por 24 horas, seguidas da perfuração com uma agulha no lado oposto à localização do embrião e expostas para coloração dos tecidos à solução de 2,3,5 trifenil brometo de tetrazólio 1%, a 30⁰C por 3 horas e em temperatura ambiente por 21 horas, em condição de escuro completo.

Para sementes de mirtilo o teste de tetrazólio, baseado na coloração dos tecidos, permite o estabelecimento de diferentes níveis de viabilidade.

4 ESTABELECIMENTO DE MIRTILEIRO IN VITRO CV. BRIGHTWELL

RESUMO

Objetivou-se neste trabalho o estabelecimento in vitro de segmentos nodais de mirtileiro cv. Brightwell, em meio de cultivo WPM, acrescido de 5 mg.L-1 _{de 2iP. As} avaliações foram realizadas aos 7, 30 e 60 dias. Explantes verdes foram considerados sobreviventes. Aos 60 dias sobreviveram 87% dos explantes, todos apresentavam primórdios foliares e apenas 53% apresentaram brotações. Algumas brotações apresentavam sinais de senescência, como amarelecimento e perda de folhas. Conclui-se que o uso do meio de cultura WPM, acrescido de 5 mg.L-1 de 2iP, no estabelecimento in vitro de segmentos nodais de mirtileiro cv. Brightwell permite a obtenção de primórdios foliares e brotações após 30 dias de cultivo.

ESTABLISHMENT IN VITRO OF BLUEBERRY CV. BRIGHTWELL

ABSTRACT

The objective of this study was the establishment in vitro of nodal segments of blueberry, variety Brightwell, in WPM culture medium, plus 5 mg.L-1 _{of 2iP.} Evaluations were performed at 7, 30 and 60 days. Green explants were considered survivors. At 60 days 87% of the explants survived, all of them had leaf primordial and 53% developed shoots. Some shoots showed senescence signs, such as yellowing and loss of leaves. It was concluded that the use of WPM culture medium, plus 5 mg.L-1 2iP, in vitro establishment of nodal segments of blueberry cv. Brightwell allows obtaining primordial leaves and shoots after 30 days of culture.

4.1 INTRODUÇÃO

Mirtileiros cultivados comercialmente derivam principalmente de quatro grupos highbush, lowbush, rabbiteye e de seus híbridos (ROWLAND et al., 2012). O grupo rabbiteye compreende a espécie Vaccinium ashei Reade (FACHINELLO, 2008) considerada a mais promissora para a maior parte das regiões de clima frio do sul do Brasil, onde o mirtileiro tem maior possibilidade de adaptação (PEÑA, et al., 2012). Entre os mirtileiros do grupo rabbiteye podemos citar as cultivares Brightwell, Climax, Delite, Powderblue e Woodard (LYRENE; BALLINGTON, 2006).

O principal entrave desta cultura, no entanto, reside na produção de mudas tradicionalmente propagadas por estacas, processo que resulta em baixo rendimento, além de não apresentar garantia de sanidade (SILVA et al., 2006). Entre os métodos assexuados de propagação de plantas, a micropropagação ou propagação in vitro tem sido muito estudada e utilizada porque permite o controle de variáveis responsáveis pelo desenvolvimento da planta (GRIMALD et al., 2008). Não há, porém, definição de um protocolo de micropropagação único para todas as espécies, fato este devido às diferentes necessidades de cada planta, com relação a nutrientes, fotoperíodo, fisiologia, etc. (TORRES; CALDAS; BUSO, 1998).

A micropropagação é uma técnica que permite o rejuvenescimento do material vegetal (TITON et al., 2003), como forma de reverter as plantas do estádio maduro para o juvenil (WENDLING; XAVIER, 2001). O rejuvenescimento pode aumentar o vigor e auxiliar no desenvolvimento vegetativo das plantas (SOUZA et al., 2011). No caso do mirtileiro do grupo rabbiteye, cv. Climax, Schuch et al. (2008) observaram que o material vegetal adulto cultivado in vitro tem elevada habilidade de rejuvenescimento após repiques sucessivos na presença de citocinina, podendo ser comparado às plantas obtidas de semente, tanto na capacidade de emitir novas brotações, quanto ao número de gemas e taxa de multiplicação.

O primeiro estágio da micropropagação é o estabelecimento do material in vitro (CARDENAL; MALDONADO, 2010) que pode ser realizada através de segmentos nodais, internodais, cotiledonares e ápices caulinares (PAIVA; ALOUFA, 2009). Para o estabelecimento in vitro de mirtileiros cvs Delite, Flórida, Powderblue, Bluebelle, Bluegem, Briteblue e Woodard, os explantes constituíram-se de

segmentos nodais isolados de brotações laterais novas de aproximadamente 15 cm, originadas de ramos lenhosos obtidos dentro da sala de crescimento (SILVA et al., 2008).

Nesta fase inicial, a desinfestação dos explantes pode ser realizada através da imersão em álcool 70% (10 segundos), seguida de imersão em hipoclorito de sódio com 2,5% de cloro ativo, acrescido de 2 gotas de Tween 20 (10 minutos) e, após, tríplice lavagem com água destilada e autoclavada (SILVA et al., 2006). Pós- desinfestação, os explantes são inoculados em meio de cultura, onde podem permanecer por 20-30 dias, entretanto a ocorrência de oxidações e/ou contaminações pode ser perceptível já na primeira semana de cultivo (DUTRA; WENDLING; BRONDANI, 2009). Rosa et al. (2009) demonstraram que um período de escuro diminui a oxidação dos explantes de mirtileiros cultivares Georgia e O’neal in vitro.

Alguns fatores são considerados limitantes para o sucesso da micropropagação de plantas tais como: a composição do meio de cultivo, o uso de reguladores vegetais e o pH. O meio basal WPM (LLOYD & McCOWN, 1980) tem sido usado na micropropagação do mirtileiro Vaccinium highbush cv. Bluecrop desde que resultados satisfatórios foram obtidos (TETSUMURA et al., 2008). Já a zeatina, o 2iP (SILVA et al., 2006; SCHUCH et al., 2008; JIANG et al., 2009) e o AIA (SILVA et al., 2008) são utilizados como reguladores vegetais para plantas deste gênero. Segundo Erig e Schuch (2005), a adição de 24,6 µM de 2iP ao meio de cultura WPM favorece o estabelecimento in vitro de mirtileiro cv. Flórida. Em relação ao pH, mirtileiros se desenvolvem normalmente em solos ácidos (PAAL et al., 2011), sendo assim o meio de cultura para Vaccinium também tem sido acidificado (pH 5,0) (MEINERS; SCHWAB; SZANKOWSKI, 2007; JIANG et al., 2009).

Objetivou-se neste trabalho definir protocolo para estabelecimento in vitro de Vaccinium ashei Reade cv. Brightwell, em meio WPM, na presença de 2iP, com base em indicações da literatura para diferentes espécies de mirtileiros.

4.2 MATERIAL E MÉTODOS

Ramos semilenhosos de mirtileiros cv. Brightwell, coletados em agosto de 2013, no pomar experimental do departamento de Agronomia – Campus CEDETEG/UNICENTRO, localizado no município de Guarapuava – PR (25º23'36” de latitude, 51º27'19” de longitude e 1.120 m de altitude) foram cortados em segmentos de 20 cm, colocados em frascos com água e levados à sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas, temperatura de 25 ± 2⁰C e densidade de fluxo de fótons do período de luz de 27 µmol.m-2.s-1 para emissão de brotações novas (SILVA et al., 2008) de aproximadamente 2 cm.

Os brotos obtidos foram destacados dos segmentos de ramos e as folhas, descartadas. Em seguida procedeu-se a desinfestação em câmara de fluxo laminar, onde o material foi colocado em álcool 70% por 30 segundos, depois imerso em hipoclorito de sódio comercial (teor de cloro ativo de 2,0 a 2,5%) acrescido de 2 gotas de Tween 20, durante 15 minutos e a seguir, lavado por três vezes em água destilada e autoclavada (SILVA et al., 2006).

Utilizou-se o meio de cultura WPM acrescido de vitaminas de Gamborg; Miller e Ojima (1968), 30 g.L-1 de sacarose, 100 mg.L-1 de mio-inisitol e 50 mL de 2iP [100 mg.L-1] (SCHUCH et al., 2008). O pH foi ajustado para 5,0 e logo após adicionou-se 6 g.L-1 de ágar na solução. Cada tubo de ensaio recebeu 10 mL do meio de cultura e foi autoclavado a 121⁰C e 1,5 atm por 20 minutos.

Os explantes foram introduzidos nos tubos contendo o meio de cultura solidificado e levados à sala de crescimento, no escuro, por 7 dias a 25 ± 2⁰C (SILVA et al., 2006). Posteriormente, avaliou-se a porcentagem de explantes oxidados, contaminação fúngica e bacteriana. Explantes verdes foram considerados sobreviventes. Os tubos foram transferidos para a luz com fotoperíodo de 16 horas e densidade de fluxo de fótons do período de luz de 27 µmol.m-2.s-1. Aos 30 e 60 dias foram avaliados a porcentagem de sobrevivência, o desenvolvimento de primórdios foliares e a emissão de brotações.

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste trabalho a segmentação dos ramos do mirtileiro cv. Brightwell e seu acondicionamento em sala de crescimento permitiram o desenvolvimento de novas brotações. Explantes obtidos a partir de segmentos nodais destas brotações, desinfestados e acondicionados no escuro por 7 dias, exibiram tanto porcentagem de contaminação por fungos/ bactérias quanto oxidação nula (100% dos explantes sobreviveram) (Gráfico 4). Na primeira semana de cultivo in vitro é possível observar a ocorrência de contaminações e/ou oxidação (DUTRA; WENDLING; BRONDANI, 2009). O conteúdo de compostos fenólicos nos tecidos vegetais, que podem levar a oxidação, depende da cultivar e de suas características genéticas (SILVA et al., 2008). Alternativamente a acomodação dos explantes na ausência de luz nos sete primeiros dias de estabelecimento in vitro ajuda a evitar a oxidação fenólica (DUTRA; WENDLING; BRONDANI, 2009).

Depois de 30 dias de cultivo, 100% dos explantes continuavam verdes, porém apenas 93% desenvolveram primórdios foliares e destes, 40% apresentaram brotações (Gráfico 4 e Figura 4a). Segundo Erig e Schuch (2005), casos em que os explantes continuam vivos (de coloração verde), mas não emitem folhas, podem ser justificados pelo grau de desenvolvimento da gema do explante.

Aos 60 dias, sobreviveram 87% dos explantes. Todos apresentavam primórdios foliares e destes, 53% apresentavam brotações (Gráfico 4). Ao final do teste, algumas brotações apresentavam folhas com bordas amareladas, pigmentação vermelha no centro e também queda de folhas, sinalizando senescência (Figura 4b).

GRÁFICO 4 - Porcentagem de sobrevivência, emissão de primórdios foliares e brotações, no estabelecimento in vitro de mirtileiro (Vaccinium ashei Reade) cv. Brightwell, através de segmentos nodais

FIGURA 4 - Estabelecimento in vitro de mirtileiro (Vaccinium ashei Reade) cv. Brightwell. a) Brotação aos 30 dias de cultivo. b) Brotação senescente aos 60 dias de cultivo

O meio de cultura WPM e suas variações têm sido utilizado com sucesso no estabelecimento in vitro de Vaccinium ashei Reade, cvs. Delite (SILVA et al., 2006), Flórida, Powderblue, Bluebelle, Bluegem, Briteblue e Woodard (SILVA et al., 2008); Brightwell e Choice (JIANG et al., 2009), devido à sua menor concentração de sais quando comparado a outros meios utilizados no cultivo in vitro. A menor salinidade

do WPM auxilia na diminuição do potencial osmótico e, consequentemente, na disponibilidade de água para o material vegetal (NOGUEIRA et al., 2004).

Jiang et al. (2009) utilizaram zeatina para introduzir o cv. Brightwell in vitro, porém os altos custos, demandados pelo uso deste regulador do crescimento no meio de cultura, dificultam a elaboração de protocolos comerciais. Neste estudo mostramos que o uso do 2iP é uma alternativa ao uso da zeatina para obtenção de gemas axilares em explantes desta cultivar.

As brotações obtidas neste estudo apresentavam em média 5 folhas e tamanho médio 0,5 cm (Figura 4a), inferior ao obtido por Schuch et al. (2008), com explantes de Vaccinium ashei Reade, cv. Climax cultivadas em meio de cultura contendo 2iP (1,5 cm). No estabelecimento do mirtileiro in vitro, é comum o desenvolvimento de explantes com crescimento ativo, que emitem brotos alongados e com várias gemas, enquanto outros emitem brotos sem alongamento, com folhas grandes que paralisam o desenvolvimento (ERIG & SCHUCH, 2006). Jiang et al. (2009) também detectaram esse fenômeno na micropropagação de mirtileiro cv. Choice e sugere que, após um ou dois subcultivos, a juvenilidade de alguns brotos pode ser recuperada. A micropropagação do mirtileiro depende da obtenção de brotações alongadas e com características de juvenilidade na etapa de estabelecimento in vitro.

4.4 CONCLUSÃO

O uso do meio de cultura WPM, acrescido de 5 mg.L-1 de 2iP, no estabelecimento in vitro de segmentos nodais de mirtileiro cv. Brightwell, permite a obtenção de primórdios foliares e brotações após 30 dias de cultivo.

5 ESTABELECIMENTO IN VITRO DE MIRTILEIRO (Vaccinium ashei Reade) CV. BRIGHTWELL CULTIVADO COM TIOSSULFATO DE PRATA

RESUMO

Durante o cultivo in vitro o acúmulo de etileno no interior do recipiente de cultivo pode ser prejudicial à cultura. Uma alternativa para evitar a formação de etileno e que tem trazido bons resultados no desenvolvimento das plântulas encontra-se na adição de tiossulfato de prata (STS), um inibidor da síntese deste hormônio. Baseando-se neste conhecimento, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência STS no estabelecimento in vitro de mirtileiro (Vaccinium ashei Reade) cv. Brightwell. Foram utilizados segmentos nodais, em meio de cultura WPM, suplementado com 50 mL de 2iP [100 mg.L-1_{] e STS nas concentrações de 0, 15, 30,} 45 e 60 µM. Após 60 dias foi avaliada a porcentagem de explantes sobreviventes e que desenvolveram primórdios foliares, número de gemas com brotações, comprimento da maior brotação e número de folhas. Os dados obtidos foram submetidos a análise de variância e quando significativos comparados pelo teste Duncan (p≤ 0,05) e mostrados por regressão polinomial. O efeito da concentração de STS utilizada foi significativo ao nível de 5% de probabilidade para os parâmetros número de gemas com brotações e de folhas e favorecidos pelo uso de 45 µM de STS.

ESTABLISHMENT IN VITRO OF BLUEBERRY (Vaccinium ashei Reade) CV. BRIGHTWELL CULTIVATED WITH SILVER THIOSULFATE

ABSTRACT

During the culture in vitro the ethylene accumulation inside the culture recipient can be detrimental to culture. An alternative to avoid the formation of ethylene and that has brought good results in seedling development is the addition of silver thiosulfate (STS), an inhibitor of the synthesis of this hormone. Based on this knowledge, the present study aimed to evaluate the influence STS the in vitro establishment of blueberry (Vaccinium ashei Reade ) cv. Brightwell. Nodal segments were used, in WPM culture medium, supplemented with 50 mL of 2iP [100 mg.L-1] and STS at concentrations of 0, 15, 30, 45 e 60 µM. After 60 days was assessed the percentage of surviving explants and that developed leaf primordia, number of buds with shoots, length of longer budding and number of leaves. The data obtained were submitted to analysis of variance and, when significant, compared by Duncan test (p ≤ 0.05) and shown by polynomial regression. The effect of STS concentration used was significant at 5% probability for the parameters number of buds with shoots and leaves and favored by the use of 45 µM of STS.

5.1 INTRODUÇÃO

A micropropagação é baseada na proliferação de gemas axilares e na capacidade de células de plantas maduras diferenciadas em rediferenciarem-se buscando desenvolver novos centros meristemáticos capazes de regenerar plantas normais (DEBNATH, 2011). Numerosos estudos sobre a cultura in vitro de Vaccinium spp. têm sido publicados há mais de 20 anos (LITWIŃCZUK; WADAS- BOROŃ, 2009; ROSS; CASTILLO, 2009) e envolvem a cultura de meristemas e o uso de segmentos contendo tanto gemas apicais quanto laterais como explantes (DEBNATH, 2011).

Plantas cultivadas in vitro sintetizam etileno (STEINITZ et al., 2010), que regula muitos aspectos do ciclo de vida das plantas (LIN; ZHONG; GRIERSON, 2009) desde a germinação das sementes até a senescência de órgãos (BLEECKER; KENDE, 2000). Na cultura de tecidos, o gás etileno produzido pelo material vegetal volatiliza e permanece preso nos frascos de cultivo, em torno dos explantes. O acúmulo deste hormônio no interior do recipiente durante a micropropagação pode ser desfavorável para o desenvolvimento da cultura (STEINITZ et al., 2010), acelerando o processo de senescência.

Compostos como o nitrato de prata (AgNO3) e o tiossulfato de prata (STS) são utilizados para inibir a ação do etileno na cultura de tecido in vitro (MARUTANI- HERT et al., 2011). Steinitz et al. (2010) observaram que o uso de AgNO3 no meio de cultura sólido reage com algumas marcas comerciais de ágar, corando os géis em diferentes tonalidades e levando à formação do precipitado de cloreto de prata (AgCl). Os íons de prata adicionados no meio de cultura na forma de STS regulam significativamente a atividade do etileno na maioria das plantas (SRIDHAR; PREETHI; NAIDU, 2011) e seu mecanismo de inibição do etileno se deve à substituição do cofator Cu pelo íon Ag+_{, impedindo as alterações necessárias para a} transmissão do sinal aos receptores de etileno (BINDER, 2008).

Em Prunus americana L. o uso do STS aumentou a regeneração a partir de folhas adventícias (BURGOS; ALBURQUERQUE, 2002). Em Stevia rebaudiana houve efeito positivo sobre a formação de brotações (PREETHI; SRIDHAR; NAIDU, 2011), assim como em P. serotina (LIU; PIJUT, 2008). Já em segmentos nodais de

diferentes espécies de citros o STS reduziu a queda de folhas (MARUTANI-HERT et al., 2011).

Desta forma, objetivou-se neste trabalho foi avaliar a influência do tiossulfato de prata no estabelecimento in vitro de mirtileiro (Vaccinium ashei Reade) cv. Brightwell a partir de segmentos nodais.

5.2 MATERIAL E MÉTODOS

Ramos semilenhosos de mirtileiros cv. Brightwell, coletados em agosto de 2013, no pomar experimental do departamento de Agronomia – Campus CEDETEG/UNICENTRO, localizado no município de Guarapuava, PR (25º23'36” de latitude, 51º27'19” de longitude e 1.120m de altitude) foram cortados em segmentos de 20 cm, colocados em frascos com água e levados à sala climatizada com ar condicionado (temperatura de 25⁰C ± 2⁰C), com fotoperíodo de 16 horas e densidade de fluxo de fótons do período de luz de 27 µmol.m-2_.s-1_{. Os segmentos} permaneceram nestas condições até a emissão de brotações (SILVA et al., 2008) com aproximadamente 2 cm, as quais foram destacadas dos ramos. Após a retirada das folhas procedeu-se a desinfestação dos brotos em câmara de fluxo laminar. Inicialmente o material foi mergulhado em álcool 70% por 30 segundos, seguido da imersão em hipoclorito de sódio (2,5% de cloro ativo) adicionado de 2 gotas de Tween 20, durante 10 minutos (SILVA et al., 2006). Após a desinfestação, os ramos foram lavados por três vezes em água estéril. Em seguida foram preparados os explantes mantendo-se duas gemas e aproximadamente 1 cm de comprimento.

O meio de cultura utilizado para inoculação do material in vitro foi o WPM (LLOYD; McCOWN, 1980) suplementado de 50 mL de 2iP [100 mg.L-1], 30 g.L-1 de sacarose, 100 mg.L-1 de mio-inisitol (SCHUCH et al., 2008). O pH foi ajustado para 5,0 antes da inclusão de 6 g.L-1 de ágar. O meio de cultura foi previamente autoclavado a 121⁰C e 1,5 atm por 20 minutos. O tiossulfato de prata 0,02 M foi preparado no momento do uso, em seguida esterilizado em filtro Millipore® com membrana de 0,22 µ de diâmetro do poro e acrescido ao meio de cultura basal numa temperatura de 50-60⁰C.

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco concentrações de STS (0, 15, 30, 45 e 60 µM), quatro repetições e parcela experimental com 5 tubos de ensaio com um explante cada. Após a inoculação dos explantes, os tubos foram vedados com tampa plástica e mantidos em sala climatizada com ar condicionado (temperatura constante 25⁰C ± 2⁰C), no escuro por sete dias (SILVA et al., 2006) e posteriormente foram analisadas as variáveis porcentagens de explantes oxidados, contaminação fúngica e bacteriana.

A seguir os tubos foram transferidos para a luz com fotoperíodo de 16 horas e densidade de fluxo de fótons do período de luz de 27 µmol.m-2_.s-1_{.Após 60 dias da} instalação do experimento, foi avaliada a influência do STS no estabelecimento in vitro de mirtileiro cv. Brightwell através da porcentagem de explantes sobreviventes (verdes) e de explantes que desenvolveram primórdios foliares, número de gemas com brotações, comprimento da maior brotação e número de folhas. Os dados de número de gemas com brotações, comprimento da maior brotação e número de folhas foram transformados para √y+1. A seguir todos os dados foram submetidos ao teste de Bartlett, seguido de análise de variância e, quando significativos, comparadas pelo teste Duncan (p≤ 0,05) e regressão polinomial pelo programa estatístico SAS.

5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nos sete primeiros dias da instalação do experimento, os tubos de ensaio foram acomodados no escuro. Após este período, a contaminação fúngica foi de 7% para o tratamento com 60 µM de STS. Para os demais tratamentos tanto a contaminação bacteriana quanto a fúngica foi nula. Também não ocorreu a oxidação dos explantes. A oxidação fenólica pode ser observada na cultura de tecidos in vitro, durante o rompimento celular, após a excisão do explante (DAS; PAL, 2005). O acondicionamento dos explantes no escuro na primeira semana do estabelecimento in vitro contribui para evitar esse fenômeno (DUTRA; WENDLING; BRONDANI, 2009).

Os dados de porcentagem de explantes sobreviventes (verdes) e de explantes que desenvolveram primórdios foliares, após 60 dias do estabelecimento in vitro, em meio de cultura contendo diferentes concentrações de STS, são apresentados na Tabela 2. Na avaliação final do experimento não houve diferença significativa entre os tratamentos em relação à porcentagem de explantes sobreviventes (verdes). Entre os explantes sobreviventes que desenvolveram primórdios foliares, os melhores resultados foram observados nos tratamentos que continham STS na composição do meio de cultura. Para todos os tratamentos, a porcentagem média de explantes sobreviventes foi superior à porcentagem média de explantes que desenvolveram primórdios foliares, o que mostra que nem todos os explantes que sobreviveram, desenvolveram primórdios.

TABELA 2 - Porcentagem de explantes sobreviventes e que desenvolveram primórdios foliares, após 60 dias de cultivo in vitro, de mirtileiro Vaccinium ashei Reade cv. Brightwell, em meio de cultura contendo diferentes concentrações de STS. Ponta Grossa, 2013

STS (µM) Porcentagem Média de Explantes Sobreviventes Porcentagem Média de Explantes com Primórdios Foliares 0 86,67 ns 53,33 B 15 73,33 ns 60,00 Ab 30 86,67 ns 80,00 Ab