Anticorpo Monoclonal X Fluorocromo
5. CONCLUSÃO GERAL
Nossas análises quantitativas mostraram que indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam uma contagem de células T CD4+ e CD8+ maior, porém proporcinal nas duas células, e valores menores de células NK, quando comparados aos controles não infectados. Apesar de não apresentar diferenças estatísticas nos valores de linfócitos B entre os dois grupos, atentamos para a necessidade de estudos de padronização quantitativa dessas células, bem como de células NK, na população brasileira.
Destacamos a observação da baixa expressão do regulador da transcrição gênica (Foxp3) em células com fenótipo CD3+CD4+CD25+, atentando para necessidades de estudos voltados para este grupo células, que pode estar relacionada em um mecanismo fundamental para a compreensão celular HTLV-1 patogenicidade.
Nossos resultados indicam que o Lymphogram® pode ser utilizado em diferentes contextos de investigação, como o diagnóstico e monitoramento na infecção pelo HTLV-1. A investigação de biomarcadores por citometria de fluxo é uma técnica estabelecida na enumeração das subpopulações de linfócitos T para a monitorização de pacientes com vírus da imunodeficiência humana (HIV). As vantagens na utilização deste reagente é identificação simultânea, rápida e de baixo custo das quatro principais subpopulações linfocitárias, porém é uma limitação do reagente a dificuldade de identificação das células NKT, pois o anticorpo anti-CD3+ e o anti-CD56+ utilizam o mesmo fluorocromo, o R-ficoeritrina (PE). Essa limitação pode ser solucionada, adicionanda anti-CD3+ conjugado ao fluorocromo Aloficocianina (APC), para detecção intracelular de CD3+. Nossos resultados corroboram com Giustolisi e col. e Bellido e col., que ao comparar imunofenotipagem linfocitária realizada por painel de citometria de fluxo convencional e o
Lymphogram®, também mostraram que não haviam discrepâncias na
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APÊNDICE A
Médianas dos valores absolutos de células T totais, T CD4+ e T CD8+ de indivíduos infectados pelo HTLV e controles não-infectados do presente estudo, e medianas encontradas por Torres e col. em 2013, incluindo no estudo 645 doadores adultos e 280 crianças saudáveis de 280 voluntários (148 na Bahia e 132 no Rio de Janeiro), utilizando o kit Multitest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems,)+Trucount tubes, e analisando os anticorpos anti-CD3+, anti-CD8+, anti-CD45+ e anti-CD4+.
HTLV-1 Controles TORRES 2013
Não infectados
Lymphogram Tritest Lymphogram Tritest Multitest
CD3+ 1642 1322 1576 1404 1585
CD4+ 1027 802 940 788 931
CD8+ 532 433 535 505 541
APÊNDICE B
Médias [mínimo e máximo] dos valores relativos de células T totais, T CD4+, TCD8+, células NK e linfócitos B de indivíduos infectados pelo HTLV-1 do presente estudo (segunda e terceira colunas), médias [mínimo e máximo] dos valores relativos de linfócitos T descritos por Torres e col. (quarta coluna) e médias [mínimo e máximo] dos valores relativos do intervalo de referência indicado Lymphogram® (última coluna).
Infectados HTLV Não infectados HTLV Torres et al. Intervalo de Referencia Lymphogram® CD3 74,88 [39,6-92,0] 67,75 [42,5-86,3] 77,9 76.6 [50,8-88,7] CD3+CD4+CD8- 47,24 [21,3-76,6] 41,68 [28,0-64,1] 42,2 48.1 [24,4-67,1] CD3+CD4-CD8+ 24,47 [9,6 - 51,0] 21,75 [11,0-34,0] 25,4 23.7 [12,6-53,6] CD56+CD3- 13,83 [3,2 - 35,9] 18,43 [4,3 - 43,4] --- 9.7 [2,07-24,4] CD19+CD3- 10,8 [3,2 - 23,6] 13,8 [4,0 – 57,0] --- 13.0 [4,98-25,5]
Médias±DP dos valores relativos células T totais, T CD4+, TCD8+, células NK e linfócitos B de indivíduos infectados pelo HTLV-1 do presente estudo (primeira e segunda colunas), E médias±DP dos valores relativos de linfócitos T, NK e B descritos por Brito-Mello e col. (2002) (terceira, quarta, quinta e sextacolunas), em 74 indivíduos infectados pelo HTLV-1(18 assintomáticos,14 oligossintomáticos e 42 HAM/TSP definido) com 32 controles.
ANEXO B
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Projeto de Investigação:
Biomarcadores imunológicos no monitoramento da infecção pelo HTLV-1
Pesquisadores Responsáveis: Dra Maria Fernanda Rios Grassi Médico Responsável: Dr. Bernardo Galvão
Prezado paciente:
O Sr(a) está sendo convidado para participar desta pesquisa que pretende verificar se pacientes infectados pelo HTLV apresentam alguma diferença na atividade das células do sangue. A infecção pelo vírus chamado HTLV-1 pode causar dois tipo de doença: uma leucemia (câncer de glóbulos brancos do sangue) ou uma doença do sistema nervoso, que causa paralisia, porém muitas pessoas não apresentam nenhuma doença. Este estudo pretende buscar diferenças nos exames das pessoas que são infectadas por esse vírus e tem manifestações diferentes (tem doença ou não tem nenhum sintoma). Nesse sentido, acreditamos que esse estudo poderá ser contribuir para que no futuro os pacientes possam ser tratados antes de manifestarem a doença.
Para que isso seja possível realizar esta pesquisa pedimos a doação de uma amostra de sangue para realizar exames de laboratório, sorologia (HIV, virus das hepatites C e B) e para ensaios de pesquisa das células de defesa. Essas amostras serão obtidas no momento em que exames de sangue forem necessários para o seu próprio acompanhamento clínico. Aproveitaremos o pedido de coleta de sangue para o exame de rotina, e solicitaremos ao laboratório que retire um pouco a mais (25ml, cerca de 5 colheres de sopa) para esta pesquisa. Esta doação ocorrerá apenas uma vez. Assim sendo, o número de vezes que o sangue será retirado não será maior do que o realmente necessário para o acompanhamento de rotina e não será necessário vir ao Centro médico apenas com o objetivo de participar da pesquisa.
A coleta de sangue será realizada por um profissional treinado, entretanto pode ocorrer uma dor ligeira e um pequeno sangramento no local da picada, ficando o braço roxo. Esta mancha desaparece dentro de 1 a 2 dias. Será realizada igualmente a coleta do líquido da coluna por um médico experiente. Para o exame, o Sr (a) estará deitado (a) de lado, com o pescoço para baixo e as pernas encolhidas. O médico limpa a coluna e anestesia o local e coloca a agulha de punção entre a quarta e a quinta vértebras lombares. O líquido drenado é colocado nos tubos de ensaio e enviado para o laboratório para análise. Após o exame, o médico comprime o local com as mãos e coloca um bandaid. Depois do exame a pessoa pode ter dor de cabeça, 12 horas a 2 dias depois. Pode haver também dor na nuca e coluna, dormência nas pernas, rigidez do pescoço, vômitos e náuseas, visão turva, tonturas, vertigem ou zumbido. TODOS esses sintomas melhoram com medidas simples como ficar em deitar e beber muito líquido. Este exame
só será realizado se o médico detectar alterações no sistema nervoso qu precise ser diagnosticada com este exame.
A sua participação neste estudo é voluntária e espontânea. A sua assistência médica não será modificada em função da sua aceitação ou não em participar deste estudo. Também não envolverá nenhum custo adicional. Caso necessite regressar ao hospital por razões ligadas ao estudo, suas despesas com transporte e alimentação serão pagas pelos responsáveis pela pesquisa.
Além disso, você poderá desistir de participar a qualquer momento sem que isto interfira no tratamento futuro neste hospital. O material obtido de sua amostra de sangue (plasma e células) será utilizado apenas neste estudo. Toda a informação obtida ou disponibilizada neste estudo será considerada como sigilosa de modo a garantir confidencialidade e não será divulgada sem a sua permissão.
Para que outros médicos possam no futuro ampliar seus conhecimentos sobre esta doença, gostaríamos de mostrar os resultados obtidos neste projeto em congressos (pôster ou apresentação oral) e em publicações em revistas científicas.
Por outro lado, nos comprometemos a não dizer seu nome e a utilizar os resultados obtidos apenas com finalidade científica.
A equipe de pesquisadores (Dr Bernardo Galvão, Dra Fernanda Grassi) está disponível a qualquer momento para qualquer esclarecimento no número 3176-2213.
Caso queira, o Sr (a) poderá entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisas da Fiocruz pelo telefone 3176-2285.
Eu _________________________________________________ aceito fazer parte do grupo de estudo “Biomarcadores imunológicos no monitoramento da infecção pelo HTLV-1”
Recebi todas as orientações sobre este trabalho. Entendi o propósito do estudo, e compreendo que o objetivo deste estudo é uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na infecção causada pelo vírus HTLV-1. Sei que este trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Humana.
Estou recebendo uma cópia deste documento datada e assinada, e não estou abdicando de nenhum dos meus direitos legais.
Salvador, ____ / ____ / ______.
Assinatura: _____________________________________________________ Assinatura da Testemunha: _________________________________________
ANEXO C
Figura: Intervalo de referência indicado pelo Lymphogram. Fonte: Prospecto do kit Lymphogram
Figura: Intervalo de referência indicado pelo Tritest. Fonte: Prospecto do kit Tritest.