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CONCLUSÃO
A quantificação de taninos através da metodologia de Difusão Radial se mostrou bastante rápida, segura, econômica e muito útil em estudos onde uma grande quantidade de amostras precisa ser analisada. Fato este devido a sua simplicidade quando comparada as outras metodologias que na maioria das vezes são métodos laboriosos e empregam reagentes específicos. Entretanto o método deve ser usado com cautela, não sendo recomendada para determinação do valor do teor total de taninos e sim como uma medida do potencial biológico destas moléculas.
Foi demonstrado neste trabalho que algumas alterações no processo de extração da metodologia original, ocasionam a otimização deste método, uma vez que aumentam sua sensibilidade, reduzindo o tempo e a quantidade de material vegetal empregado na análise.
A substituição do metanol 50%, utilizado na metodologia original, pela acetona 50% acarretou em aumento do diâmetro dos discos em todas as condições testadas, propondo um maior poder extrativo deste solvente nas condições testadas. A combinação do emprego da acetona 50% com a utilização do ultrassom reduziu a metade o tempo necessário para extração e quantidade de massa vegetal, eliminando as divergências de resultados devido a não saturação dos solventes observadas com a maceração.
Através do estudo de validação, o método foi considerado linear, preciso, robusto e exato, uma vez que os valores encontrados para estes parâmetros estão dentro do intervalo aceitável. O estabelecimento dos limites de detecção e quantificação revelou um método bastante sensível.
Com os resultados obtidos no estudo de validação pode-se confirmar que o método é ideal para o doseamento de taninos, podendo ser utilizado com segurança para as aplicações analíticas. A validação do método, por sua vez, aumenta a credibilidade nos resultados dos ensaios de quantificação por ele já realizados.
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PERSPECTIVAS
O doseamento de taninos através da difusão radial tem se mostrado um método promissor, pois é simples rápido e eficiente. Contudo há a necessidade de aprimoramento da técnica para obtenção de resultados padronizados e consequente aumento da credibilidade destes.
A otimização do processo de extração e a validação do método foram um passo importante para o alcance desse objetivo, uma vez que a utilização do ultrassom aliado à pesquisa por um solvente com maior capacidade extratora para taninos minimiza as disparidades nos resultados decorrentes de um processo extrativo ineficiente.
Por sua vez a validação do método é a prova documentada de que este satisfaz os requisitos para as aplicações analíticas praticadas, essencial a qualquer metodologia.
Muito ainda pode ser feito, existem ainda várias etapas do método que podem ser estudadas e melhoradas a fim de tornar a difusão radial uma ferramenta eficiente e confiável para os laboratórios de análises.
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APÊNDICE – Artigo enviado para Revista Brasileira de Plantas Medicinais
Validação de metodologia analítica para determinação de taninos pelo método de difusão radial
Validation of analytical methodology for determination of tannins by radial diffusion method
LGSantos1*; TJSPeixoto Sobrinho1; DLVCabral1; ELCAmorim1
1
Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas - Centro de Ciências da Saúde Universidade Federal de Pernambuco - Av. Prof Arthur de Sá, s/n, Cidade Universitária 54740-521 - Recife - PE, Brasil
* Corresponding author: lumagomes_68@hotmail.com
RESUMO
A metodologia para doseamento de taninos através de difusão radial desenvolvido por Hagerman (1987) vem sendo utilizada em laboratórios de fitoterápicos devido principalmente a sua simplicidade de execução, rapidez e baixo custo, contudo não há relatos na literatura da submissão desta metodologia a um estudo de validação. Baseando-se neste fato, o presente estudo visou validar a metodologia de Difusão Radial para o doseamento de taninos. Todos os parâmetros obrigatórios exigidos pela RE 899 de 2003 foram avaliados. O método foi considerado linear e com alta sensibilidade de quantificação (27,72 µg/poço). Mostrou-se também robusto e com recuperação aceitável (85,96%). Os resultados obtidos para repetitividade (intra-corrida) e precisão intermediária (inter-corridas), certificaram a precisão do método, obtendo-se valores entre 1,89 e 7,03%. Para a exatidão valores entre 100,47 e 105,26% foram obtidos, que se encontra dentro dos limites preconizados pela ANVISA. Sendo assim o
método foi considerado preciso, exato e reprodutível, além de ser de fácil execução e baixo custo.
Palavras-chave: difusão radial, doseamento de taninos, validação de método, quantificação.
ABSTRACT
The methodology for determination of tannins by radial diffusion developed by Hagerman (1987) has been explicitly used in herbal laboratories due mainly to its simplicity of implementation, speed and low cost, yet there are no reports in the literature of the submission of this methodology to a study validation. Based on this fact, this study sought to validate the methodology of Radial Diffusion in the tannins determination. All mandatory parameters required by ANVISA were evaluated. The method was considered linear and with high sensitivity quantitation (27.72 g / well). It was also shown robust and acceptable recovery (85.96%). The results obtained for repeatability (within-run) and intermediate precision (inter-run), certified the accuracy of the method, obtaining values between 1.89 and 7.03%. For the accuracy values between 100.47 and 105.26% were obtained, which is within the limits recommended by ANVISA. Thus the method was considered precise, accurate and reproducible, and is easy to perform and inexpensive.
Key words: radial diffusion, tannins content, method validation, quantification.
INTRODUÇÃO
Milhões de medições analíticas são efetuadas a cada dia em laboratórios ao redor do mundo e, verifica-se a necessidade progressiva de dados analíticos comparáveis e consistentes, para a eliminação de barreiras técnicas entre os vários países. Para atingir este processo de reconhecimento mútuo a nível internacional, em que uma vez efetuada a medição, esta é aceita em qualquer país, requisitos legais, de certificação e de credenciamento devem ser observados. As normas internacionais, nacionais e sistemas da qualidade destacam a importância da validação de métodos analíticos e a documentação do trabalho de validação, para a obtenção de resultados confiáveis e adequados ao uso pretendido (Barros, 2002).
De acordo com a United States Pharmacopeia XXXIII (2010), “A validação de métodos assegura a credibilidade destes durante o uso rotineiro, sendo algumas vezes mencionado como o processo que fornece uma evidência documentada de que o método realiza aquilo para o qual é indicado para fazer”, ou seja, é a confirmação por exame e fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinado uso pretendido são atendidos (NBR ISO/IEC 17025, 2001). As características analíticas típicas usadas na validação de métodos são: exatidão, precisão, especificidade, limite de detecção, limite de quantificação, linearidade, intervalo de aceitação, robustez ou resistência e conformidade do sistema (Brasil, 2003; Espires, 1998; Pecora, 2000; Pinto et al., 2003). Portanto, a validação de metodologias analíticas necessita ser especifica, robusta, sensível, precisa e exata, constituindo fundamental importância para o controle de qualidade dos produtos e sendo parte das normas de Boas Práticas de Fabricação e Controle (Barros Neto et al., 2002).
A realização da validação deve ser executada: i) sempre que de forma direta ou indireta quando o processo de fabricação tenha sido alterado; ii) quando a qualidade final do produto for duvidosa; iii) em equipamentos novos e iv) em caso de implantação de um processo ou método analítico novo (Emanuelli, 2000; Pasteelnick, 1993).
O método de difusão radial desenvolvido por Hagerman (1987) para o doseamento de taninos se fundamenta na propriedade que estes metabólitos secundários possuem de se complexar com as proteínas. No ensaio, o tanino difunde por um gel contendo proteína e o precipitado desenvolve uma forma de disco visível à medida que o tanino interage com a proteína. O método é simples, sensível e específico, e deve ser especialmente aplicado para estudos nos quais um grande número de amostras será analisado. Apesar de já bastante utilizado e difundido na comunidade acadêmica, não há relatos de que a metodologia tenha passado por um processo de validação, estudo este de extrema importância para se garantir a confiabilidade do método. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi realizar a validação da metodologia analítica de quantificação de taninos por difusão radial.
Reagentes e equipamentos
O solvente usado foi metanol (Vetec Química Fina, 99,8%). Os reagentes foram ácido acético glacial (Merck, 99,8%), hidróxido de sódio (Vetec Química Fina, 99%), ácido ascórbico 99,5% (Vetec Química Fina), agarose tipo I (Sigma-Aldrich) e albumina sérica bovina fração V livre de ácidos graxos (Sigma-Aldrich). Como padrão para taninos foi utilizado ácido tânico 99,5% (Vetec Química Fina).
As pesagens foram realizadas em balança analítica Shimadzu AX200 e as diluições com micropipetas monocanal de volume variável HTL Lab Solutions. A bancada de vidro foi nivelada com inclinômetro Insize C7. As análises de pH foram realizadas em pHmetro de bancada Tecnopon mPA210.
Preparação do gel
Foi preparada uma solução 50 mM de ácido acético e 60 μM de ácido ascórbico, sendo o pH ajustado para 5,0 pela adição de hidróxido de sódio em pérolas pois este é o pH ideal para a interação tanino-proteína (López et al., 2004). O gel foi preparado utilizando agarose (1%, p/v) na solução descrita previamente. A mistura foi homogeneizada sob aquecimento e, após o resfriamento a 45°C, foi adicionada albumina sérica bovina (0,1%, p/v). Alíquotas de 10 mL do gel foram distribuídas em