Durante este trabalho, desenvolvemos o software PS3A como prova de conceito, demonstrando que é possível ver um sinal na região onde o EES está presente. Os gráficos da Fig. 62 demonstram um comportamento dentro das α-hélices, que não é o mesmo visto nas folhas-β. Porém, essa diferença, além de ser subjetiva porque depende da visão de quem a analisa, é insuficiente para se fazer uma classificação robusta de um EES em seu nano- ambiente. Assim, o próximo passo foi aplicar testes estatísticos no conjunto de dados, para comprovar estatisticamente o que foi observado visualmente.
Os primeiros testes estatísticos aplicados foram univariados, onde nós usamos apenas um descritor em cada teste. Primeiramente aplicamos os testes nas estruturas alinhadas por tamanho, e neste caso, tivemos uma taxa de sucesso de aproximadamente 20%, onde definimos taxa de sucesso o p-value < 10-3. Entretanto, o alinhamento por tamanho está sujeito à introdução de ruído, uma vez que o número de amostras decresce nas regiões periférias à estrutura alinhada. Para diminuir o ruído e melhorar o resultado, alinhamos as estruturas pelo seu C-Terminal e N-Terminal. Os resultados obtidos foram melhores. No caso das proteínas do tipo all-β, a taxa de sucesso foi um pouco acima de 70%, e nos demais casos a taxa de sucesso foi superior a 90%.
Aprofundando a investigação, nós submetemos os dados à análise MANOVA. Os resultados da MANOVA aplicada às estruturas alinhadas por tamanho foi sensivelmente melhor que àqueles obtidos nos testes univariados. Enquanto para os testes univariados a taxa de sucesso ficou em 20%, no teste MANOVA a taxa de sucesso foi em média de 80%.
Portanto, o uso da análise multivariada mostrou-se mais eficaz que os testes aplicados em um único descritor. Isso demonstra que o nano-ambiente funciona como um sistema chave-fechadura, onde todas as ranhuras da chave precisam estar devidamente ajustadas, caso contrário a fechadura não irá abrir. Em nosso caso, todos os descritores de um conjunto selecionado pelo teste MANOVA devem ter seus valores ajustados para aquele nano-ambiente, caso contrário, o EES não se manterá.
Ao compararmos os descritores mais usados pelo teste MANOVA e que foram comuns para os diversos nano-ambientes, concluímos que o número de ligações de hidrogênio entre cadeias principais é maior nas α-hélices que nas folhas-β, o potencial eletrostático no carbono-α é α-hélices que nas folhas-β, o número de contatos não realizados é maior nas α- hélices que nas folhas-β, a capacidade de fazer contatos cruzados (Cross_Link) é maior nas
folhas-β que nas α-hélices, a acessibilidade à superfície em isolação é maior nas α-hélices que nas folhas-β, a densidade na superfície e no interior da proteína é maior nas α-hélices que nas folhas-β. Essas especificidades são como as ranhuras da chave, que a fazem específica para a sua fechadura.
Três categorias de descritores foram identificados entre as mais frequentemente usados para identificação das α-hélices e também das folhas-β: número de contatos do tipo ligações de hidrogênio entre cadeias principais (em valores absoluto, ponderado pela distância e ponderado pela superfície), o número de contatos não realizados, densidade na superfície e densidade interna.
Alguns descritores foram selecionados pelo teste MANOVA apenas para a identificação de um EES específico. A acessibilidade na superfície e a capacidade de fazer contatos cruzados foram usados na identificação das folhas-β, e o número de contatos não realizados foi usado na identificação das α-hélices. Concluímos que cada EES tem um nano- ambiente exclusivo, determinado por um conjunto de descritores específico.
Porém, o teste MANOVA não pôde ser aplicado em todos os casos de estruturas alinhadas pelo N-Terminal e C-Terminal, porque os dados não apresentaram uma distribuição normal, condição sine qua non para esse tipo de análise. Entretanto, isso abre espaço para uma discussão mais aprofundada sobre o que acontece no início e no final das α-hélices e das folhas-β, o que certamente será tema de trabalho futuro do GPBC.A perspectiva atual do GPBC é reunir todos os diferentes nano-ambientes estudados – hot spots, interface proteína- proteína, sítio catalítico, interface proteína-ligante, EES – para que sejam abordados, classificados e descritos em um único trabalho, gerando uma compilação de dados que poderá ser descrita como um dicionário proteico.
Conforme demonstrado no estudo de caso apresentado, onde comparamos duas estruturas idênticas, uma delas com resolução de 1.7 Å e a outra com resolução de 3.6 Å, a metodologia desenvolvida neste trabalho pode ser usada como uma nova métrica para avaliação de estruturas resolvidas ou modelos de estruturas produzidos pelos mais diversos métodos.
A integração de diversas metodologias computacionais, entre elas, o alinhamento sequencial com homólogos distantes, modelagem por homologia, predição de regiões de interação entre proteínas, DNA e outras macromoléculas, docking, dinâmica molecular etc., é tida como o objetivo final para um melhor entendimento dos processos que acontecem dentro
e fora da célula. Especificamente, esperamos que o conhecimento adquirido durante este trabalho ajude na importante tarefa de prever regiões contendo um EES e também de avaliar os modelos gerados, o que será útil para o desenho racional de drogas e agroquímicos e estudos bioquímicos sobre os resíduos de aminoácido importantes para o estabelecimento da função proteica.
Esse trabalho focou no estudo dos nano-ambientes onde as α-hélices e as folhas-β estão inseridas. Mas, a abordagem usada abriu o caminho para um estudo mais aprofundado do tema. Por exemplo, embora os algoritmos DSSP e Stride separem as estruturas helicoidais em α-hélices, π-hélices e hélices 310, neste trabalho nós as colocamos em um único grupo. Uma abordagem mais aprofundada, em um próximo trabalho, será estudar cada um desses tipos individualmente. O mesmo vale para as folhas-β, que poderão ser sub-divididas em folhas-β paralelas e anti-paralelas e estudadas separadamente. Finalmente, os turns poderão ser alvo de um novo trabalho investigativo.
Nós publicamos um artigo científico na revista PlosOne41 sobre o nano-ambiente onde as α-hélices estão presentes (anexo 1). Queremos publicar um segundo artigo, contendo as análises, resultados e conclusões sobre o nano-ambiente onde as folhas-β estão inseridas.