Conclusões e perspetivas de trabalhos futuros

La caractérisation de la MOD a été effectuée le premier et le dernier jour des expérimentations sur les

mêmes conditions que pour les analyses de COD : les témoins biotiques et abiotiques (sans pesticides), et

les traitements pesticides qui ont eu un effet important sur les microalgues. Cette caractérisation a été

effectuée par spectroscopie d’absorbance UV-Visible et de fluorescence.

6.4.1. Spectrophotométrie UV-Visible

Le principe de cette méthode repose sur le fait que seules les molécules fortement conjuguées absorbent

une partie du rayonnement lumineux (Di Benedetto & Breuil, 2007, Skoog et al., 2003). La quantité de

lumière absorbée, essentiellement dans l’UV et le visible, est fonction de la composition atomique et

principalement des liaisons entre atomes. En effet, une molécule comportant des chromophores où les

atomes sont liés par une ou plusieurs double-liaisons absorbe, contrairement aux molécules composées de

liaisons simples (Skoog et al., 2003).

L’absorption est directement liée à la concentration des molécules absorbantes d’après la loi de

Beer-Lambert :

- .

_/

ℓ1

Où : – A correspond à l’absorbance pour une longueur d’onde λ (sans unité) ;

– ε

λ

correspond au coefficient d’extinction molaire (en L.mol

^-1

.cm

^-1

) ;

– ℓ correspond à la longueur du trajet optique parcouru (en cm) ;

– c correspond à la concentration en mol.L

^-1

des molécules qui absorbent à la longueur d’onde λ.

L’absorbance peut également être déterminée grâce à une autre expression de la loi de Beer-Lambert. Cette

équation est la suivante :

- log ⁵

5

Où : – I

0

correspond à l’intensité de la lumière incidente ;

– I correspond à l’intensité de la lumière transmise.

À partir des spectres d’absorption réalisés pour chaque échantillon, deux paramètres couramment utilisés

Chapitre 2 – Matériels et Méthodes Caractérisation de l’environnement chimique 95 0 10 20 30 40 50 60 210 260 310 360 410 460 510 560 610 660 Longueur d'onde (nm) Absorbance

S

S_{275nm275nm--295nm295nm}

S

S_{350nm350nm--400nm400nm}

L’indice S

R

ou rapport de pentes spectrales est un paramètre utilisé comme proxy de la variation du poids

moléculaire moyen de la MOD contenue dans l’échantillon. Il est calculé de la façon suivante (Helms et al.,

2008) (Figure 31) :

6

₇

⁶

^89:;8<:

6

_{=: ;>}

Où : – S

275-295

correspond à la pente du spectre d’absorption calculée entre 275 et 295 nm ;

– S

350-400

correspond à la pente du spectre d’absorption calculée entre 350 et 400 nm.

Figure 31 : Spectre d’absorption typique sur lequel sont indiquées les pentes spectrales utilisées dans le calcul de l’indice S_R.

Helms et al. (2008) ont montré que cet indice était inversement corrélé au poids moléculaire moyen

(diminution du poids moléculaire moyen = augmentation du S

R

).

L’indice SUVA

254

(Specific UV Absorbance à 254 nm) fournit des informations sur le caractère

aromatique de la MOD. Cet indice est supposé augmenter avec l'aromaticité, l’hydrophobicité et le poids

moléculaire de la matière organique (Labanowski, 2004). Une augmentation de ce paramètre traduit une

augmentation du caractère aromatique global de la MOD présente dans les cultures. Il est calculé de la

façon suivante (Weishaar et al., 2003) :

6?@-

_8:>

^-AB

^8:>

CDE ^F100

Où : – Abs

254

représente l’absorbance à 254 nm ;

– [COD] représente la concentration en carbone organique dissous (en mg.L

^-1

).

L’appareil utilisé est un spectrophotomètre UV-Visible (JASCO V-560, France) équipé d’une lampe à

décharge au deutérium (pour l’émission entre 190 et 350 nm) et d’une lampe à filament de tungstène (pour

l’émission entre 330 et 900 nm). L’échantillon est placé dans une cuve en quartz de 1 cm de trajet optique

(Hellma, Müllheim, Allemagne). L’acquisition des spectres a été réalisée de 210 à 700 nm, avec un pas de

Chapitre 2 – Matériels et Méthodes Caractérisation de l’environnement chimique

96

1 nm et une vitesse de balayage de 200 nm.min

^-1

. Aux spectres des échantillons est systématiquement

soustrait le spectre d’absorption de l’eau ultrapure (Milli-Q, Millipore), réalisé au préalable dans la même

cuve afin de retirer la part d’absorption liée à l’eau et à la cuve elle-même.

6.4.2. Spectrofluorimétrie

L’énergie absorbée par les molécules provoque leur passage à un état excité. Cet état excité est

thermodynamiquement instable (Figure 32). Aussi, l’énergie absorbée doit être restituée afin que les

molécules puissent revenir à leur état fondamental. Cette restitution peut s’effectuer sous forme d’émission

de chaleur (relaxation non rayonnante pouvant se faire sous forme de conversion interne, de relaxation

vibrationnelle, etc.) ou sous forme d’émission de photons (relaxation sous forme de fluorescence). Sur la

totalité des chromophores contenus dans la MOD, seuls les fluorophores (comme les cycles aromatiques)

réémettent de la lumière (Aiken, 2014a, Reynolds, 2014) ; les autres restituent l’énergie sous forme de

chaleur. Le rayonnement réémis par les molécules disposant de fluorophores possède une énergie inférieure

au rayonnement d’excitation. Pour faire passer une molécule d'un état d'énergie basal à un état excité, il faut

lui fournir une quantité d'énergie équivalente à la différence entre ces deux niveaux. Toutefois l'énergie

émise est toujours plus faible que celle d'excitation puisqu'il y a des pertes au sein de la molécule. La

longueur d’onde du rayonnement émis est donc toujours supérieure à celle d'excitation (Reynolds, 2014,

Skoog et al., 2003). L’étude par fluorescence de la MOD apporte des informations qualitatives et

semi-quantitatives (composition relative) sur le type de molécules fluorescentes présentes.

Figure 32 : Diagramme de Perrin-Jablonski (Huguet, 2007).

Les analyses des échantillons ont été réalisées à l’aide d’un spectrofluorimètre Fluorolog FL3-22 (Horiba

Jobin-Yvon, France) équipé d’une lampe à arc Xenon (de 450 W) et de double monochromateurs à

l’excitation et à l’émission. Les échantillons contenus dans une cuve en quartz de 1 cm de trajet optique

Chapitre 2 – Matériels et Méthodes Caractérisation de l’environnement chimique

97

(Hellma, Müllheim, Allemagne), étaient thermostatés à 20°C dans le compartiment échantillon. Les

analyses de fluorescence ont été réalisées dans des conditions de faible absorbance (absorbance <0,1 au

maximum d’absorbance, ici 250 nm) afin d’éviter les effets de filtre interne et d’être dans un domaine de

linéarité entre intensité de fluorescence et concentration.

La fluorescence tridimensionnelle, ou matrice d’excitation-émission de fluorescence (EEM en anglais), a

été largement appliquée à l’étude de la MOD dans les eaux naturelles (Coble et al., 2014, Findlay &

Sinsabaugh, 2003). Les matrices de fluorescence sont en fait des cartes de fluorescence de l'ensemble des

fluorophores d'un mélange. Elles permettent de caractériser plusieurs composés dans un mélange. Elles

renseignent ainsi sur les sources, la composition, le degré de dégradation/transformation et la réactivité de

la MOD (Moncada, 2004, REPAR, 2015, Tapie et al., 2016).

Les spectres de fluorescence 3D sont composés de 17 spectres d’émission acquis de 260 à 700 nm (avec un

incrément de 1 nm et un temps d’intégration de 0,5 sec) pour des longueurs d’onde d’excitation allant de

250 à 410 nm (avec un incrément de 10 nm). L’acquisition des matrices de fluorescence est réalisée en

mode S/R (S = « sample », R = « reference » correspondant à l’énergie de la lampe mesurée par une

photodiode de référence) afin de s’affranchir des variations d’énergie de la lampe. À chacun de ces spectres

a été soustrait le spectre de fluorescence 3D d’un blanc enregistré quotidiennement avec de l’eau ultrapure

Milli-Q dans la même cuve que celle utilisée pour les échantillons. Cette soustraction a pour but d’éliminer

les biais liés à la cuve elle-même et d’éliminer les diffusions Rayleigh et Raman liées aux phénomènes de

diffusion de la lumière dans l’eau Milli-Q.

Sur les spectres de fluorescence, on observe en effet des pics étroits dus aux phénomènes de diffusion. La

diffusion Rayleigh est due à l’interaction entre des photons et des molécules d’eau. C’est une diffusion

élastique, c’est-à-dire qu’elle se produit sans modification de l’énergie des photons. Les bandes résultantes

sont observées à la longueur d’onde d’excitation. La diffusion Raman résulte aussi de l’interaction

photons/molécules d’eau. C’est une diffusion non élastique, c’est-à-dire qu’une partie de l’énergie des

photons est perdue. La longueur d’onde de diffusion Raman est supérieure à la longueur d’onde

d’excitation.

Une correction instrumentale est ensuite réalisée afin de s’affranchir des biais liés à l’appareillage (Huguet

et al., 2009b). L’ensemble des spectres 3D acquis a été converti en unités Raman (voir la publication de

Huguet et al. (2009b) pour le détail de la normalisation par la bande Raman de l’eau Milli-Q).

La Figure 33 montre les principaux pics de fluorescence observés pour les eaux naturelles. Les

caractéristiques de ces composants en termes de composition et de longueurs d’onde d’excitation et

d’émission sont données dans le Table 11.

Chapitre 2 – Matériels et Méthodes Caractérisation de l’environnement chimique

98

Deux autres paramètres peuvent également être calculés à partir de ces spectres : les indices HIX et BIX.

L’indice HIX ou indice d’humification, lié au caractère aromatique de la molécule, permet d’estimer le

degré d’évolution dans le processus d’humification de la MOD (Zsolnay et al., 1999). Il est calculé en

faisant le rapport de deux aires (H et L) du spectre d’émission enregistré pour une longueur d’onde

d’excitation de 254 nm (Figure 34) :

=

Où: – H correspond à l’aire sous la courbe entre les intensités émises allant de 435 à 480 nm ;

– L correspond à l’aire sous la courbe entre les intensités émises allant de 300 à 345 nm.

Excitation (nm) 260 280 300 320 340 360 380 400 E m is s io n ( n m ) 300 350 400 450 500 550 600 650 700 0.000 0.015 0.030 0.045 0.060 0.075 0.090 0.105 0.120 0.135 0.150 0.165 0.180 0.195 0.210 0.225 0.240 α αα α' αααα ββββ γγγγ

Figure 33 : Exemple de spectre de fluorescence 3D obtenu avec un échantillon contenant de la MOD marine du Bassin d’Arcachon sur lequel sont représentées les principales bandes de fluorescence observées.

Table 11 : Principaux fluorophores des eaux naturelles (d'après Parlanti et al., 2000).

Type de composés ^{Longueur d’onde} d’excitation (nm)

Longueur d’onde d’émission (nm)

α' ^{Substances de type humique (acides humiques et fulviques) +}

matériel récent ^{250 – 260 380 – 480}

α Substances de type humique 340 – 370 420 – 480

β Production récente de matériel 310 – 320 380 – 420

γ ^{Composés de type protéique + activité microbienne et}

Chapitre 2 – Matériels et Méthodes Analyses statistiques

99 Figure 34 : Délimitation des domaines H et L permettant le calcul de l’indice HIX sur le spectre d’émission typique

pour une longueur d’onde d’excitation de 254 nm (d'après Zsolnay et al., 1999).

Une augmentation de HIX traduit une augmentation du caractère aromatique des molécules (déplacement

du spectre vers les grandes longueurs d’onde) reflétant des phénomènes de condensation, de polymérisation

des molécules et donc un degré de maturation plus important de la MOD.

L’indice BIX, également appelé indice biologique, est un indicateur de production autotrophe, autrement

dit de contribution autochtone récente (Huguet et al., 2009b). Il correspond au ratio entre l’intensité émise à

380 nm (correspondant au maximum d’émission du fluorophore β) et l’intensité émise à 430 nm

(correspondant au maximum d’émission du fluorophore α) pour une longueur d’onde d'excitation de

310 nm. Plus il augmente, plus la contribution de la bande β et donc la production autochtone de MOD, est

importante.

No documento Caracterização mecânica do material compósito LITECOR para um processo de conformação plástica (páginas 113-127)