bacteria with distinct metabolic profiles
7. CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA A CONTINUIDADE DO TRABALHO
No presente trabalho foram utilizadas diferentes abordagens para mapear a produção de metabólitos, o consumo de diferentes fontes de carbono e as principais reações do metabolismo do carbono central da Salmonella typhimurium LT2.
O metabolismo da glicose por S. typhimurium foi detalhadamente estudado em cultivos batelada, batelada-alimentada e contínuos. Os fluxos de consumo de glicose e de
produção de metabólitos e de CO2 em quimiostatos conduzidos em diferentes taxas de diluição
revelaram que, mesmo em condições de grande limitação do crescimento, como velocidade específica de crescimento de 0,1 h-1 e fluxo de glicose de 1,7 mmol g
DCW-1 h-1, houve desvio do carbono fornecido para a produção de acetato. Esse resultado foi diferente do esperado, tendo em vista que a formação de acetato em quimiostatos de E. coli, com glicose como fonte de carbono, só ocorre a partir de taxas de diluição superiores a 0,4 h-1. A formação de acetato em baixas velocidades específicas de crescimento torna muito mais difícil o estabelecimento de uma estratégia de cultivo em batelada alimentada para obtenção de alta concentração celular de
S. typhimurium tendo glicose como fonte de carbono, conforme o presente trabalho mostra. Um
melhor desempenho do cultivo em batelada alimentada talvez possa ser alcançado diminuindo a concentração inicial de glicose na batelada para 5 g L-1, diminuindo a temperatura e controlando o fornecimento de meio suplementar de forma que a velocidade específica de crescimento seja mantida em 0,1 h-1.
Além dos estudos com glicose, cultivos conduzidos com xilose e glicerol como fontes de carbono também foram realizados. Os resultados obtidos com os substratos alternativos mostraram que, mesmo em condições plenamente aeróbias, parte do carbono assimilado é direcionada para a formação de acetato, porém em menor proporção. Mesmo para um fluxo de consumo de glicerol de 18,5 mmolglicerol gDCW-1h-1, o dobro do valor calculado para a assimilação de glicose, o fluxo de formação de acetato foi de apenas 0,9 mmolacetato gDCW-1h-
1, cerca de 10 vezes menor do que o obtido com glicose. Consequentemente, o rendimento em
biomassa atingiu 0,57 gDCW gglicerol-1, sendo 40 % superior ao observado quando glicose foi empregada como fonte de carbono. Assim, a utilização de glicerol como fonte de carbono, em substituição à glicose, mostrou-se uma estratégia promissora para cultivos em batelada alimentada e merece ser explorada em futuros trabalhos. Sugere-se ainda que o estudo do
metabolismo do glicerol por S. typhimurium seja aprofundado e detalhado utilizando cultivos em quimiostatos e a análise dos fluxos metabólicos com carbono marcado.
O ácido acético foi a quarta fonte de carbono estudada no presente trabalho. Constatou-se que a Salmonella possui via (s) metabólica (s) que permitem a assimilação do acetato, assim como a Escherichia coli, gênero bacteriano considerado o mais próximo à
Salmonella. Entretanto, o fluxo de assimilação desta fonte de carbono e a velocidade de
crescimento da Salmonella são muito inferiores aos valores relatados para diferentes estipes de
E. coli. Apesar das vias de assimilação/formação de acetato estarem bem caracterizadas na
literatura para E. coli, há controvérsia sobre o papel desempenhado pelos sistemas enzimáticos acetato-quinase/fosfotransacetilase (Ack-Pta) e acetil-CoA sintetase (Acs). Tendo em vista que a compreensão sobre o metabolismo do acetato é fundamental para estabelecer estratégias que diminuam sua formação, sugere-se que estudos específicos do metabolismo desse ácido orgânico sejam conduzidos na continuidade do trabalho. Seria importante conduzir experimentos em diferentes concentrações iniciais de acetato para acompanhamento das atividades das enzimas Ack-Pta e Acs. Além disso, a construção de mutantes com deleções de genes das vias de assimilação do acetato poderia elucidar o papel desempenhado por essas enzimas. Este trabalho também descreve uma estratégia de cultivo em batelada-alimentada com glicose, como fonte de carbono, que não foi eficiente para a produção de altas concentrações celulares de Salmonella, mesmo mantendo a concentração residual de glicose em níveis baixos. Através deste experimento verificou-se que a abordagem mais adequada para a identificação de condições de cultivo que favorecessem o crescimento celular seria a realização de cultivos contínuos.
Os fluxos de consumo de substrato e formação de produtos calculados a partir dos dados de cultivos em quimiostato com glicose foram ainda empregados para avaliar o modelo metabólico em escala genômica STM_v1.0, reconstruído para Salmonella typhimuriu LT2, proposto por Thiele e colaboradores (2011). Verificou-se que os resultados simulados se ajustaram melhor aos dados gerados em cultivos de E. coli, uma vez que este modelo é derivado de um modelo metabólico em escala genômica de E. coli K-12. O fraco desempenho do modelo disponível na literatura, no contexto estudado, é reflexo das diferenças no metabolismo das bactérias E. coli e S. typhimurium reveladas no presente trabalho.
Para o desenvolvimento de um novo modelo capaz de descrever com mais precisão o metabolismo de S. typhimurium, informações adicionais sobre os fluxos metabólicos são necessárias. Assim, a metodologia de análise dos fluxos metabólicos com carbono marcado
vias do metabolismo do carbono central a partir dos dados obtidos em cultivos contínuos com glicose marcada com 13C, conduzidos nas taxas de diluição de 0,24 e 0,48 h-1. Os resultados preliminares obtidos sugerem grandes diferenças no metabolismo da S. typhimurium nestas duas taxas de diluição, particularmente em relação à via predominantemente utilizada pela
Salmonella após a entrada da glicose na célula. Na taxa de diluição de 0,24 h-1, o carbono foi
direcionado para a via da pentose fosfato e glicólise, enquanto que na taxa de diluição de 0,48 h-1, a glicose foi catabolisada, predominantemente, pela via Entner-Doudoroff.
Para concluir os estudos de análise dos fluxos metabólicos, sugere-se que cultivos contínuos de S. typhimurium, com glicose isotopicamente marcada, sejam realizados
nas taxas de diluição de 0,1 e 0,7 h-1, para que as mudanças nos fluxos das vias metabólicas
observadas no presente trabalho possam ser confirmadas.
Futuramente, os resultados obtidos neste trabalho poderão ser utilizados para aprimorar os modelos metabólicos em escala genômica existentes para Salmonella. O melhor conhecimento sobre o metabolismo de S. typhimurium poderá auxiliar no desenvolvimento de medicamentos para prevenção de infecções causadas por Salmonella, assim como na exploração dessa bactéria como plataforma para produção de importantes produtos farmacêuticos.