Conclusões e perspectivas

No presente trabalho foi avaliado o potencial do intron A e de seqüências indutoras de Z-DNA em melhorar a atividade da luciferase, que foi o modelo de estudo para o teste das construções realizadas. Verificou-se que o intron A inteiro promove um aumento significativo da atividade da luciferase em todas as linhagens celulares estudadas, sendo que este aumento varia de 100 a quase 1000 vezes, este último para a linhagem HEK-293. Este resultado é corroborado pelo aumento nos níveis de expressão do transcrito da luciferase de vaga-lume, como visto nos experimentos de RT-qPCR. Foram construídas versões do intron A deletado ainda não descritas na literatura, sendo que a versão com deleção de 600 pb pode ser considerada um intron A mínimo funcional, tendo em vista que a atividade da luciferase se manteve praticamente inalterada nas linhagens de células de mamífero analisadas. A construção com deleção de 200 pb também apresentou aumentos de 2 a 7 vezes na atividade da luciferase, dependendo da linhagem celular utilizada, sendo que esta foi a melhor construção dentre todas. Os dados do experimento de RT-qPCR também confirmam que há uma relação entre a atividade da luciferase observada nas construções com deleção de 600 e 200 pb com os níveis de expressão do mRNA. Foi também mostrado que o splicing nas construções em que foi deletado o sítio 3’ aceptor (pGLCMV∆400 e pGLCMV∆600) não ocorre normalmente como na construção com intron A selvagem e deletado em 200 pb. Nestas construções o sítio aceptor permaneceu inalterado. Como os níveis da atividade da luciferase na construção pGLCMV∆600 são tão bons quanto ou melhores do que os da versão com intron A inteiro, pode-se inferir que o splicing nesta região entre o exon 1 e 2 não é crítico para que haja melhora da expressão gênica. Com isso, pode ser que o mRNA híbrido de luciferase com a região 5’UTR do gene IE1 de CMV seja funcional, produzindo a proteína biologicamente ativa.

Foi demonstrado também que a seqüência indutora de Z-DNA Z3 foi capaz de aumentar em aproximadamente 2,5 vezes a atividade da luciferase em comparação com a construção Z5. Os valores um pouco menores da atividade da luciferase da construção Z3 em comparação com a construção selvagem (pGLCMV) são explicados pela deleção da região 5’ do promotor/enhancer de CMV entre os sítios de restrição de Ssp I. Esta região ao contrário do que foi descrito na literatura, tem uma importância significativa para a expressão gênica, visto que sua remoção das construções com seqüências

indutoras de Z-DNA diminuíram pela metade a atividade da luciferase em CHO-K1 e em COS-7. Com a utilização do fragmento de anticorpo scFv Z22 com NLS foi possível demonstrar, em clones estáveis de Z3 e Z5 em CHO-K1, que há grandes indícios de que a seqüência Z3 exerça a sua atividade moduladora por meio da formação de Z-DNA, visto que a transfecção transiente desta construção nos clones estáveis aumentou significativamente a atividade da luciferase em Z3, e não em Z5, o controle.

Com isso, este trabalho mostrou a influência de elementos em cis (introns e seqüências indutoras de Z-DNA) e em trans (fragmento de anticorpo anti-Z-DNA) na atividade da luciferase. Estes elementos têm o potencial de otimizar a expressão gênica em várias linhagens de células de mamífero, sendo alvos interessantes para o estudo mais aprofundado e posterior construção de vetores para expressão de proteínas heterólogas de interesse comercial.

Dentre as perspectivas futuras para este trabalho, que terá continuidade por mais quatro anos como um projeto de Doutorado, estão:

- clonagem e seqüenciamento dos fragmentos de DNA obtidos nas reações de RT-PCR para o estudo do splicing nas construções com deleções no intron A.

- restauração do sítio aceptor de splicing na construção pGLCMV∆600, por meio de PCR.

- estabelecimento de novos clones estáveis em CHO-K1 das construções com os oligonucleotídeos Z12, Z3 e Z5 para estudos dos padrões de metilação no promotor de CMV por meio de seqüenciamento bissulfito e tratamento com 5-azacitidina.

- imunoflorescência e imunoprecipitação de cromatina nos clones estáveis de Z3 e Z5, utilizando o anticorpo construído neste trabalho (scFvZ22 NLS), a fim de comprovar a formação de Z-DNA na região adjacente ao promotor.

- monitorar os níveis de expressão do gene da luciferase de vaga-lume por RT-qPCR nas construções com a seqüência Z3, na presença e na ausência do scFvZ22 NLS.

- construção de um novo vetor para expressão de proteínas de interesse em células de mamífero contendo uma associação dos elementos que mostraram resultados positivos para o gene repórter da luciferase. Em outras palavras, em um novo vetor seria testado o

intron A (e versões deletadas) em conjunto com o elemento Z3 e restaurando-se a região 5’ do promotor de CMV, na expressão estável de uma proteína de interesse comercial. Nesse sistema estaria incluso também a expressão transiente do scFvZ22 NLS. Na figura 30 é mostrado um esquema de como funcionariam os elementos estudados se estivessem em um mesmo vetor para expressão heteróloga de uma proteína de interesse comercial. Na figura é possível verificar como todos os elementos estudados neste trabalho podem agir de forma cooperativa para melhorar a expressão de uma proteína de interesse.

Figura 30. Mecanismos que ocasionarão aumentos na expressão de um gene de interesse quando os elementos são colocados em um mesmo vetor para expressão heteróloga. Na figura observa-se o esquema de um vetor que contém os elementos estudados neste trabalho (seqüências indutoras de Z-DNA e intron A), além do promotor de CMV dirigindo a expressão de um gene de interesse qualquer. Os mecanismos mostrados agiriam de forma sinergística, proporcionando um aumento global da produção da proteína de interesse. CMVp Z-DNA INTRON A Gene de interesse Exon 1 Exon 2

Efeitos na expressão do gene de interesse em nível de DNA

Efeitos na expressão do gene de interesse em nível de RNA

Gene de interesse Z-DNA

Indução da conformação Z no DNA adjacente ao promotor

Maior acessibilidade para a ligação de fatores transcricionais e RNA

polimerase II

+

INTRON A +

Ligação de fatores transcricionais ativadores que interagem com a

maquinaria transcricional

RNA polimerase II

+ Transcrição

Maior estabilidade do mRNA do gene de interesse

Gene de interesse

Maior produção da proteína de interesse

RNA polimerase II

scFv Z22NLS

Intron A ∆200 Intron A ∆600