MATERIAIS E MÉTODOS
4. MATERIAL E MÉTODOS
6.2 Concordância intraobservador e interobservador
É de extrema relevância a distinção das leucemias agudas conforme o tipo de linhagem, tendo em vista o impacto no prognóstico e escolha terapêutica em primeira instância. Há anos a classificação morfológica FAB tem sido o sistema de escolha, fornecendo juntamente com a citoquímica critérios para o diagnóstico diferencial destas doenças (SILVEIRA et al, 2008).
A avaliação intraobservador A revelou a concordância de 94,37% no tempo t1, com kappa de 0,88, 91,43% no t2 com kappa de 0.77 e 88,57% com kappa de 0,77 quando foi incluído a citoquímica em t3, havendo discreto aumento do percentual das análises morfológicas nos tempos t1 e t2 do que quando disponibilizado a citoquímica, contrário aos encontrados por Browman et al (1986); Chundgar et al (1992) e Kheire et al (1998), que encontraram maior concordância com a associação da citoquímica.
A concordância intraobservador B foi de 90% com kappa de 0,79 no tempo t1 e 81,43% com kappa de 0,62 no tempo t2, quando incluído a citoquímica a cordordâcia foi de 91,43%, com kappa de 0,82 evidenciando a maior contribuição da citoquímica do que os encontrados pelo observador A, similares aos encontrados por Kheire et al (1998) e Kurien et al (2013) .
67 Quando analisamos os resultados da concordância interobservadores a concordância foi de 88,57% com kappa de 0,77 e 81,43% com kappa de 0,62 nos tempos t1 et2 respectivamente, quando associados à citoquímica no tempo t3 a concordância foi de 87,14% com kappa de 0,74. Estes achados estão de acordo com aqueles encontrados por Kurien et al (2013); Kheire et al (1998) e Chundgar et al (1992).
Embora as analises tanto intraobservador quanto interobservador tenham demonstrado discretas divergências, o estudo morfológico e citoquímico demonstraram concordância substancial na diferenciação entre as linhagens NL e L, similares aos encontrados por Chundgar et al (1992), que demonstraram uma concordância intraobservador e interobservador de 76% no estudo morfológico, que aumentou substancialmente para 91% quando associado à citoquímica, evidenciando que a morfologia e a citoquímica na grande maioria dos casos podem distinguir leucemias biologicamente diferentes.
Os resultados por linhagem, pelos critérios adotados por nós, demonstraram que a distinção entre os tipos L1/L2, L3 e mieloide foram relevantes e ofereceram subsídios suficientes para o diagnóstico provável, que foram confirmados pela imunofenotipagem.
A distinção da LLA tem implicações terapêuticas importantes principalmente nas leucemias pediátricas, onde a morfologia evidenciada por blastos pequenos e homogêneos do tipo L1, citoquímica característica e faixa etária, praticamente, fornecem um diagnóstico provável, uma vez que os blastos L2 são mais comuns em adultos, a probabilidade de erro é mínima (SENGAR et al, 1999, ANGELESCU et al, 2012).
A caracterização morfológica dos mieloblastos, com ou sem bastonetes de Auer, e a presença de MPO e/ou SBB positiva definem a linhagem mieloide, se fazendo necessária a distinção da M3, uma vez que a terapêutica e o prognóstico são específicos e também nos casos de leucemia indiferenciadas com morfologia inespecífica e citoquímica negativas onde o diagnóstico é confirmado apenas com a imunofenotipagem (ANGELESCU et al, 2012, KURIEN et al, 2013).
Quanto à classificação por subtipos os observadores identificaram apenas em um pequeno número de acertos casos mieloides, diferentes daqueles observados por Browman et al (1986) e kurien et al (2013). Já os subtipos linfoides foram
68 caracterizados somente por imunofenotipagem assim como os outros estudos evidenciaram que a classificação por subtipos linfoides somente é possível através de marcadores monoclonais (KURIEN et al 2013). Entretanto, usando os critérios citados por linhagem L1/L2 e L3, como determinado mais recentemente pela OMS (Foa e Vitale (2000), foi possível aumentar substancialmente o percentual de acerto dos observadores A e B, apesar do pequeno tamanho da amostra. Não encontramos na literatura estudos que tenham agrupado os tipos linfoides baseado nestes critérios.
Alguns fatores podem ser creditados ao fato de termos encontrado menor concordância das análises de um observador quando a citoquímica foi associada à morfologia, isto pode ser justificado talvez pela habilidade do observador em realizar as análises citoquímicas, uma vez que estas não faziam parte da rotina.
Durante o período de avaliação morfológica e citoquímica, os observadores foram monitorados e foi observada com relativa frequência que a interrupção por quaisquer fatores, tempo de leitura e critérios adotados, seguramente interferiram na decisão final de cada observador. Não foi encontrado na literatura nenhum trabalho demonstrando o monitoramento do comportamento dos observadores durante período o da análise.
Acreditamos também que o ambiente, a disponibilidade de tempo, juntamente com a adoção de critérios pré-estabelecidos, podem contribuir ainda mais para a reprodutibilidade dos testes no diagnóstico das leucemias agudas.
Outro aspecto é que a classificação morfológica e a citoquímica são dependentes da interpretação humana sendo portanto sujeitas à variações, podendo predispor ao erro, também observado por Browman et al (1986) , além dos fatores pré-análíticos, analíticos e pós-analíticos como a qualidade do esfregaço, coloração e decisão do observador.
Podemos, portanto, assegurar que estas divergências não invalidam este estudo, visto que, tanto as análises intraobservador como interobservador demonstraram concordância substancial na identificação das linhagens NL e L, não contribuindo em apenas seis casos, que foram definidos pela imunofenotipagem como leucemias indiferenciadas, sendo duas M0, uma M7 e três bifenotípicas.
O diagnóstico das leucemias agudas indiferenciadas permanece ainda um problema em decorrência da insuficiência dos achados morfológicos e citoquímicos
69 para a caracterização final desta doença. Com a disponibilidade da imunofenotipagem as dificuldades têm diminuído substancialmente, no entanto Stasi et al (1995) e Silveira et al, 2008 relatam que estes métodos não são totalmente suficientes para determinar os subtipos, o uso de anticorpos monoclonais tem sido questionado, pois sua reatividade não é restrita a uma única linhagem.
Em aproximadamente 3% dos casos de leucemias agudas em adultos e 1% em crianças, mesmo com o emprego de um amplo painel de marcadores, ainda não é possível determinar a linhagem celular específica (STASI et al, 1995; SILVEIRA et al, 2008), em nosso estudo este fato foi documentado em quatro casos de leucemias mieloides agudas, confirmados pela morfologia e citoquímica, em que a imunofenotipagem não contribuiu para a definição do subtipo específico.
Segundo klobusická (2000) em determinadas situações a reação de mileoperoxidase é superior aos marcadores CD13 e CD33 na identificação da linhagem mieloide, como em alguns casos de LMA-M2 com t(8:21)(q22:q22) em que os marcadores CD13 e CD33 são negativos, no entanto a reação de MPO foi fortemente positiva.
Neste mesmo período foi realizado, por nós, um outro trabalho utilizando a mesma amostra, associando os diagnósticos morfológicos e citoquímicos, com o prévio conhecimento dos achados clínicos encontramos uma forte contribuição para o diagnóstico desta doença, onde o estudo morfológico permitiu a identificação da linhagem em 83,58%, enquanto a citoquímica em 83,80% da linhagem mieloide e 100%
da linhagem linfoide (RESENDE et al, 2013 comunicação verbal).
Os dados clínicos prévios são classicamente valiosos para o diagnóstico laboratorial, foi documentado por Browman et al (1986) que demonstrou que as informações clínicas associadas à morfologia e a citoquímica elevam substancialmente o nível de acordo entre os observadores, fato este, também decrito por Koran et al em 1975.
Estes dados confirmam a importância destes testes, podendo ser instituídos com segurança na rotina, principalmente em locais onde não há disponibilidade de recursos financeiros e de imunofenotipagem. Uma vez que os critérios morfológicos e citoquímicos estejam bem definidos, o tratamento pode ser iniciado principalmente em algumas circunstâncias, como urgências em que o quadro clínico exige rápida
70 intervenção terapêutica, sem prejuízos para o paciente até a confirmação diagnóstica definitiva pela imunofenotipagem (SENGAR et al, 2009).
Neste contexto, a concordância substancial entre os achados morfológicos e citoquímicos frente à imunofenotipagem e a possibilidade de identificar mais que 80%
das leucemias linfoides e mieloides agudas, evidenciaram a importância destes recursos, se não para o diagnóstico definitivo, pelo menos, seguramente, como medida de triagem na escolha dos anticorpos a serem empregados na imunofenotipagem e principalmente no início da terapêutica específica, crucial mediante circunstâncias de urgências que o quadro clínico exige.
Este trabalho seguramente tem também implicações pedagógicas, uma vez que a partir destas conclusões outros critérios têm sido adotados. Sugerimos também o incentivo ao estudo morfológico, uma vez que este constitui a base do diagnóstico, contribuindo de forma efetiva na elucidação destas leucemias. Fica nosso questionamento: podemos abandonar a morfologia?
71
CONCLUSÃO
72 7. CONCLUSÃO
A concordância substancial entre os diagnósticos morfológicos e citoquímicos frente à imunofenotipagem e a identificação de mais de 80% na diferenciação entre as linhagens linfoides e mieloides agudas neste estudo evidenciam a importância da morfologia e da citoquímica, se não para o diagnóstico definitivo, pelo menos, seguramente, como medida de triagem e orientação na escolha dos anticorpos a serem empregados na imunofenotipagem.
Por outro lado, este estudo corrobora a idéia de que a imunofenotipagem é um procedimento indispensável ao diagnóstico, especialmente na caracterização dos subtipos, das leucemias indiferenciadas como M0, M7 e bifenotípicas, documentadas por nós em 9% dos casos, em que a morfologia e citoquímica não contribuíram.
Acreditamos que o estudo morfológico e citoquímico no presente trabalho, embora subestimado por muitos, ainda são de contribuição relevante, principalmente em determinados serviços, que não dispõem de um amplo painel de anticorpos monoclonais e início precoce do tratamento específico em algumas emergências clínicas, até a confirmação definitiva pela imunofenotipagem.
Fica claro, portanto, que cada metodologia apresenta suas contribuições e limitações, entretanto acreditamos que estas reações podem ser utilizadas como métodos de primeira linha em conjunto com a imunofenotipagem, a citogenética e os estudos moleculares, viabilizando o diagnóstico, a terapêutica e o prognóstico, consolidando o valor da morfologia e citoquímica ainda que como método diagnóstico de triagem, útil e de grande valia na diferenciação das leucemias agudas de linhagem linfoide e não linfoides.
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81
ANEXOS
82 estudo “Contribuição das Reações Citoquímicas para o Diagnóstico Final das Leucemias Agudas.”
Os avanços na área da saúde ocorrem através de estudos como este, por isso a sua participação é importante. O objetivo deste trabalho foi realizar a análise da reprodutibilidade intra e interobservacional citológica, citoquímica e imunofenotípica no diagnóstico das leucemias agudas em um Hospital Universitário.
e caso você participe, não será necessário nenhum procedimento além do previsto, tendo em vista que a coleta de sangue periférico e punção de medula óssea fazem parte do diagnóstico e condutas de rotina.
Não será feito nenhum procedimento que lhe traga qualquer desconforto ou risco à sua vida, além do desconforto ocasionado pela coleta de sangue e medula óssea, fundamentais para diagnóstico de sua doença. Você poderá obter todas as informações que quiser e poderá não participar da pesquisa ou retirar seu consentimento a qualquer momento, sem prejuízo no seu atendimento. Pela sua participação no estudo, você não receberá qualquer valor em dinheiro, mas terá a garantia de que todas as despesas necessárias para a realização da pesquisa não serão de sua responsabilidade. Seu nome não aparecerá em qualquer momento do estudo, pois você será identificado com um número.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APÓS ESCLARECIMENTO
Título do Projeto: Contribuição das Reações Citoquímicas para o Diagnóstico Final das Leucemias Agudas.
Eu, (__________________________________________), li e/ou ouvi o esclarecimento acima e compreendi para que serve o estudo e qual procedimento a que serei submetido. A explicação que recebi esclarece os riscos e benefícios do estudo. Eu entendi que sou livre para interromper minha participação a qualquer momento, sem justificar minha decisão e que isso não afetará meu tratamento. Sei que meu nome não será divulgado, que não terei despesas e não receberei dinheiro por participar do estudo. Eu concordo em participar do estudo.
Uberaba, .../ .../...
__________________________________________ _______________________
Assinatura do voluntário ou seu responsável legal Documento de identidade ______________________________ _________________________________
Assinatura do pesquisador responsável Assinatura do pesquisador orientador
Assinatura do pesquisador responsável Assinatura do pesquisador orientador