CONFLITO DE INTERESSE

Os autores declaram não ter conflito de interesse

AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de agradecer ao Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP), ao Laboratório Nacional de Biociências (LNBio) do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), à Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPex) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) e ao Ambulatório de Úlceras Crônicas da FMB, pela disponibilização de recursos e equipamentos que contribuíram para a realização deste trabalho.

Nayara Rodrigues Vieira Cavassan 58 REFERÊNCIAS

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Nayara Rodrigues Vieira Cavassan 60 Tabela 1: Área de 37 úlceras venosas crônicas observadas num intervalo de 90 dias.

Úlceras Pacientes T= 0 (cm2₎a _(cmT= 90 2₎b _{redução da área} velocidade de (b-a) % redução da _área

1 _{ACB 20,768 5,898 -14,87} 71,60* 2 _{JRP 37,709 37,266 -0,443 1,17*} 3 _{TFCO 26,255 15,385 -10,87 41,40*} 4 _{SAA 43,768 19,285 -24,483 55,94*} 5 _{AT 19,439 15,938 -3,501 18,01*} 6 _{AT 16,021 7,757 -8,264 51,58*} 7 _{AT 8,467 10,166 1,699 -20,07†} 8 _{CCO 23,692 9,311 -14,381 60,70*} 9 _{AZM 15,753 12,971 -2,782 17,66*} 10 _{AZM 3,659 2,647 -1,012 27,66*} 11 _{TFFG 15,109 7,995 -7,114 47,08*} 12 _{MLTM 50,742 29,11 -21,632 42,63*} 13 _{MLBG 10,575 25 14,729 -139,28†} 14 _{AS 2,339 13 10,663} -455,88† 15 _{AS 11,26 29 17,992 -159,79†} 16 _{JZG 14,607 4 -11,103} 76,01* 17 _{JZG 12,416 7 -5,612 45,20*} 18 _{SLS 15,561 32,855 17,294} -111,14† 19 _{JMA 18,3 10 -8,025 43,85*} 20 _{EAR 16,854 27,275 10,421 -61,83†} 21 _{MMP 16,954 11,402 -5,552 32,75*} 22 _{MJVC 47,305 43,87 -3,435 7,26*} 23 _{MJVC 38,281 33,475 -4,806 12,55*} 24 _{JN 10,623 19,819 9,196 -86,57†} 25 _{ALM 13,044 2,473 -10,571 81,04*} 26 _{MJAM 2,629 1,209 -1,42 54,01*} 27 _{JCR 16,224 4,41 -11,814 72,82*} 28 _{ELP 30,398 55,315 24,917 -81,97†} 29 _{ELP 2,938 6,365 3,427 -116,64†} 30 _{NGC 62,733 88,473 25,74 -41,03†} 31 _{NGC 9,401 9,485 0,084 -0,89†} 32 _{GJC 18,963 2,469 -16,494 86,98*} 33 _{MARP 99,519 93,259 -6,26 6,29*} 34 _{ADE 44,146 35,849 -8,297 18,79*} 35 _{MVM 101,422 96,803 -4,619 4,55*} 36 _{JMC 17,728 16,479 -1,249 7,05*} 37 _{JMC 10,643 13,578 2,935} -27,58†

* - úlceras que apresentaram redução da área em T=90 † - úlceras que não apresentaram redução da área em T=90

Nayara Rodrigues Vieira Cavassan 61

Tabela 2: Identificação e categorização do perfil proteômicos das UVs estudadas.

Nº Identificação Código de acesso M.M.a (kDa) Contagem de espectros b Desvio Padrão c  pep. únicos d Função

p1 Albumin gi|113576 69 313,64 31,76 10.608 Transportadora p2 Serotransferrin gi|313104271 77 40,91 6,61 4.157 Transportadora p3 Complement C3 gi|119370332 187 20,41 6,19 2.127 Imunomoduladora p4 Ig gamma-1 chain gi|121039 36 31,21 7,83 935 Imunomoduladora p5 Beta-globin gi|56749856 16 14,60 10,26 1.335 Transportadora p5,2 Delta-globin gi|122713 16 5,36 4,46 14 Transportadora p6 Alpha-2-M gi|308153640 163 20,34 7,32 2.402 Inibidor de protease p7 Alpha-globin gi|57013850 15 8,13 6,35 719 Transportadora p8 _{Ig -4 chain C} gi|121047 36 21,73 5,35 380 Imunomoduladora p9 Ig lambda-2 chain C gi|298351714 11 26,28 7,74 596 Imunomoduladora p9,3 Ig lambda-7 chain C gi|294956599 11 4,20 3,33 64 Imunomoduladora p10 Haptoglobin J3QLC9 451 22,96 10,60 1836 Imunomoduladora p10,1 Haptoglobin J3QLC9 451 19,44 9,46 1285 Imunomoduladora p10,2 Haptoglobin-related gi|262527547 39 6,08 3,44 275 Imunomoduladora p11 Apolipoprotein A-I gi|113992 31 15,97 4,11 108 Transportadora p11,2 Apolipoprotein A-I F8W696 30 6,00 6,77 10 Transportadora p12 Ceruloplasmin gi|116117 122 5,77 3,09 110 Transportadora p12,2 Ceruloplasmin E9PFZ2 115 3,23 2,73 1 Transportadora p13 Ig alpha-1 chain C gi|113584 38 16,55 6,66 1.383 Imunomoduladora p13,2 Ig alpha-2 chain C gi|218512088 37 10,15 4,33 6 Imunomoduladora p14 Ig gamma-3 chain C gi|193806361 41 19,04 4,44 355 Imunomoduladora p15 Ig kappa chain C gi|125145 12 23,27 5,14 74 Imunomoduladora p16 Alpha-1-acid glycoprotein gi|112877 24 5,68 2,49 483 Transportadora p17 Complement C4-B gi|476007828 193 3,38 3,50 408 Imunomoduladora p18 Vitamin D-Binding Protein gi|139641 53 8,10 2,52 593 Imunomoduladora p19 Ig gamma-2 chain C gi|218512079 36 15,32 5,09 377 Imunomoduladora p20 Alpha-2-Z-globulin gi|112910 39 3,18 1,85 296 Imunomoduladora p21 Haemopexin gi|1708182 52 8,74 3,22 822 Transportadora p22 Apoliprotein A-II gi|114000 11 7,91 2,19 745 Transportadora p23 Alpha-1B-glycoprotein gi|317373553 54 2,70 1,59 307 Imunomoduladora p24 Fibrinogen beta chain gi|399492 56 1,87 2,99 275 Proteína de matriz p25 Actin, cytoplasmic 1 gi|46397333 42 4,07 3,60 456 Proteína de matriz p25,2 Alpha-cardiac actin gi|54036697 42 1,27 1,92 49 Proteína de matriz

p26 Neutrophil defensin 1 gi|30316322 10 3,08 1,80 345

Atividade antimicrobiana p27 Apoliprotein B-100 gi|300669605 516 ,86 1,05 137 Transportadora

p28 Myeloperoxidase gi|129825 84 ,32 ,82 40

Atividade antimicrobiana p29 Fibrinogen gamma chain gi|20178280 52 1,51 2,11 228 Proteína de matriz p30 Complement factor B gi|584908 86 1,45 ,76 173 Imunomoduladora p31 Vitronectin gi|139653 54 1,22 1,14 112 Proteína de Matriz

Nayara Rodrigues Vieira Cavassan 62

p32

Histone H2A type 2-C gi|47117890 14 ,32 1,49 49

Componente genético p32,2

Histone H2A type 1-J gi|12585257 14 ,30 1,42 2

Componente genético p33 Alpha-1-antitrypsin gi|1703025 47 12,73 5,10 1451 Inibidor de protease

p34 Lactotransferrin gi|85700158 78 ,52 1,93 54

Atividade antimicrobiana p35 Alpha-1-acid glycoprotein gi|231458 24 2,78 1,67 214 Transportadora p36 Beta-2-glycoprotein 1 gi|543826 38 ,67 ,85 94 Proteína de matriz p37 Fibrinogen alpha chain gi|1706799 95 1,87 1,70 212 Proteína de matriz p38 Ig heavy chain V-III TUR gi|123858 12 ,78 ,88 106 Imunomoduladora

p39 Histone H2B type 1-D gi|21542074 14 ,53 1,22 65

Componente genético p40 Apoliprotein A-IV gi|93163358 45 ,51 ,95 54 Transportadora p41 Plasma protease C1

inhibitor gi|124096 55 ,30 ,41 51 Imunomoduladora p42 Ig kappa chain V-III gi|125797 12 ,70 ,71 92 Imunomoduladora p43 Cytokeratin-6A gi|1346344 60 ,07 ,19 25 Proteína de matriz p44 Ig heavy chain V-III BRO gi|123845 13 1,10 1,12 15 Imunomoduladora

p45 Titin gi|384872704 3816 ,06 ,20 7

Componente genético p46 Keratin I cytoskeletal 16 gi|23503075 51 ,07 ,28 9 Imunomoduladora p46,2 Keratin I cytoskeletal 14 gi|229463044 52 ,01 ,06 2 Proteína de matriz p47 Ig mu chain C region gi|193806374 49 2,88 3,14 361 Imunomoduladora p48 Histidine-rich glycoprotein gi|123523 60 ,77 ,79 95 Imunomoduladora p49 Isoform Kininogen-1 P01042-2 719 ,67 ,70 117 Inibidor de protease

p50 Angiotensinogen gi|113880 53 ,50 ,72 53

Atividade antimicrobiana p51 Alpha-1 type I collagen gi|296439504 139 ,26 ,52 50 Proteína de matriz p52 Alpha-1-antichymotrypsin gi|112874 48 ,33 ,78 41 Inibidor de protease p53 Neutrophil elastase gi|119292 29 ,19 ,38 44 Imunomoduladora p54 Fibronectin gi|300669710 263 ,21 ,47 33 Proteína de matriz p55 Stratifin gi|398953 28 ,08 ,43 28 Proteína de matriz p56 Glyceraldehyde-3-

phosphate dehydrogenase gi|120649 36 ,34 ,78 30 Proteína de matriz p57 Plastin-2 gi|308153685 70 ,22 ,41 27 Imunomoduladora p58 Alpha-enolase gi|119339 47 ,17 ,42 30 Proteína de matriz p59 Antithrombin-III gi|113936 53 ,16 ,36 20 Proteína de matriz p60 Lumican gi|20141464 38 ,11 ,58 17 Proteína de matriz p61 Serum amyloid A-1 protein gi|395406826 14 ,19 1,06 15 Imunomoduladora p62 Inter-alpha-trypsin inhibitor

heavy P19827-3 101 ,11 ,29 15 Inibidor de protease p63 Cytokeratin-1 gi|238054406 66 ,15 ,38 19 Proteína de matriz p64 Lipocalin-2 gi|1171700 23 ,15 ,55 15 Transportadora p65 Inter-alpha-trypsin inhibitor

heavy chain H4 gi|229463048 103 ,08 ,35 13 Imunomoduladora p66 Inter-alpha-trypsin inhibitor gi|229462889 106 ,07 ,22 13 Transportadora

Nayara Rodrigues Vieira Cavassan 63

heavy chain H2

p67 Lysozyme C gi|48428995 17 ,08 ,28 16

Atividade antimicrobiana p68 Zinc-alpha-2-glycoprotein gi|292495049 34 ,08 ,24 14 Imunomoduladora p69 Clipin-A gi|1706004 51 ,10 ,36 8 Proteína de matriz p70 Apolipoprotein E gi|114039 36 ,05 ,23 11 Transportadora

p71 Histone H4 gi|51317339 11 ,02 ,11 11

Componente genético p72 Ig kappa chain V-III VG gi|125811 13 ,07 ,33 10 Imunomoduladora p73 Cytokeratin-10 gi|269849769 59 ,02 ,12 5 Proteína de matriz p74 Gelsolin gi|121116 86 ,07 ,39 6 Proteína de matriz

Nayara Rodrigues Vieira Cavassan 64 Tabela 3: Coeficientes da PLS das amostras escalonadas e os valores de VIP

Model Coefficients for Centered and Scaled Data

Variable Importance Table

Amostras Coeficiente Amostras VIP

protein 1 -0,01 protein 1 0,58 protein 2 0,09 protein 2 1,35 protein 3 -0,02 protein 3 1,27 protein 4 0,06 protein 4 1,23 protein 5 0,02 protein 5 0,32 protein 5,2 0,02 protein 5,2 0,49 protein 6 0,02 protein 6 0,51 protein 7 0,07 protein 7 1,06 protein 8 -0,07 protein 8 0,98 protein 9 -0,04 protein 9 0,55 protein 9,3 0,13 protein 9,3 2,11 protein 10 -0,02 protein 10 0,43 protein 10,1 -0,01 protein 10,1 0,39 protein 10,2 -0,06 protein 10,2 1,00 protein 11 0,03 protein 11 0,88 protein 11,2 0,02 protein 11,2 0,58 protein 12 0,01 protein 12 0,77 protein 12,2 -0,06 protein 12,2 1,37 protein 13 -0,04 protein 13 0,59 protein 13,2 -0,01 protein 13,2 0,28 protein 14 0,01 protein 14 0,78 protein 15 -0,10 protein 15 1,38 protein 16 0,09 protein 16 1,33 protein 17 -0,07 protein 17 1,27 protein 18 -0,04 protein 18 0,90 protein 19 -0,05 protein 19 0,74 protein 20 0,09 protein 20 1,26 protein 21 -0,09 protein 21 1,49 protein 22 0,13 protein 22 1,81 protein 23 -0,04 protein 23 0,85 protein 24 -0,04 protein 24 0,84 protein 25 -0,04 protein 25 0,68 protein 25,2 0,01 protein 25,2 0,15 protein 26 0,06 protein 26 0,80

Nayara Rodrigues Vieira Cavassan 65 protein 27 -0,01 protein 27 0,82 protein 28 -0,02 protein 28 0,77 protein 29 -0,03 protein 29 0,64 protein 30 -0,01 protein 30 0,26 protein 31 0,07 protein 31 1,09 protein 32 -0,03 protein 32 0,98 protein 32,2 -0,02 protein 32,2 0,77 protein 33 0,03 protein 33 0,42 protein 34 -0,03 protein 34 0,64 protein 35 0,04 protein 35 0,72 protein 36 -0,02 protein 36 0,89 protein 37 -0,04 protein 37 0,80 protein 38 0,06 protein 38 0,88 protein 39 0,12 protein 39 1,75 protein 40 0,00 protein 40 0,73 protein 41 0,08 protein 41 1,11 protein 42 0,06 protein 42 0,94 protein 43 0,09 protein 43 1,40 protein 44 -0,03 protein 44 0,45 protein 45 -0,18 protein 45 2,52 protein 46 0,09 protein 46 1,49 protein 46,2 0,03 protein 46,2 0,66 protein 47 0,00 protein 47 0,20 protein 48 0,10 protein 48 1,39 protein 49 0,01 protein 49 0,08 protein 50 0,00 protein 50 0,81 protein 51 -0,04 protein 51 0,81 protein 52 -0,05 protein 52 0,74 protein 53 0,01 protein 53 0,26 protein 54 0,02 protein 54 0,81 protein 55 0,02 protein 55 0,36 protein 56 0,00 protein 56 0,04 protein 57 -0,05 protein 57 0,82 protein 58 -0,06 protein 58 0,90 protein 59 -0,01 protein 59 0,38 protein 60 0,01 protein 60 0,71 protein 61 0,08 protein 61 1,25

Nayara Rodrigues Vieira Cavassan 66 protein 62 -0,03 protein 62 0,80 protein 63 -0,02 protein 63 0,36 protein 64 0,02 protein 64 0,32 protein 65 -0,02 protein 65 0,75 rotein 66 -0,02 protein 66 0,88 protein 67 -0,09 protein 67 1,62 protein 68 0,00 protein 68 0,03 protein 69 -0,02 protein 69 0,35 protein 70 -0,08 protein 70 1,45 protein 71 -0,07 protein 71 1,26 protein 72 0,13 protein 72 1,94 protein 73 0,10 protein 73 1,41 protein 74 -0,06 protein 74 1,23

Nayara Rodrigues Vieira Cavassan 67 Figura 1: Diagrama (Volcano plot) das cinco proteínas que se expressaram

diferentemente entre úlceras venosas crônicas que cicatrizam (CoefT90 negativo) e que não cicatrizam (CoefT90 positivo).

Nayara Rodrigues Vieira Cavassan 68 Tabela 4: Proteínas diferencialmente expressas identificadas entre as úlceras

venosas que cicatrizam e aquelas úlceras que não cicatrizam.

Proteína Nome Código de acesso diferencial * Expressão

p45 Titina gi|384872704 C P9.3 Ig lambda VII chain C region gi|294956599 NC†

P22 Apolipoproteina A-II gi|114000 NC† P39 histona H 2B type 1D gi|21542074 NC P72 Ig kappa chain V - III region gi|125811 NC

* C - expressão diferencial em úlceras que cicatrizaram; NC - expressão diferencial em úlceras que não cicatrizaram. † Proteínas biomarcadoras em potencial de difícil cicatrização

Figura 2: Rede de interações entre as proteínas biomarcadoras APOA2 e IGLL5. A:

associação direta entre a proteína APOA2 (apolipoproteína AII) e outras moléculas reguladoras de partículas lipoproteicas do plasma; B: Ausência de associação direta entre a proteína IGLL5 (Ig lambda VII chain C region), responsável por processos imunes e APOA2.