Conservação das sementes sintéticas a curto e longo prazo

Quanto à conservação das sementes sintéticas de mangabeira, observaram-se diferenças significativas em relação à constituição da matriz de alginato sódio e as diferentes formas de armazenamento, ou seja, em geladeira a ± 4° C ou nitrogênio líquido a -196° C.

As gemas apicais envoltas em cápsulas contendo apenas meio WPM apresentaram uma taxa de regeneração de 20%, quando armazenadas à temperatura de ± 4° C, por 7 e 15 dias. Essa constituição da matriz de alginato de sódio foi pré-determinada no item 5.1. Entretanto, a mesma apresentou baixa proporção de regeneração após a conservação das sementes sintéticas em baixas temperaturas.

Vale ressaltar que, tanto o explante in vitro (gema apical) quanto a matriz de encapsulamento possui, em geral, alta quantidade de água (Engelmann, 2004; Santos, 2004), o que dificulta o seu armazenamento.

Diante do exposto, testou-se o acréscimo de sacarose nas concentrações de 1 e 3% e da solução A (2,0 M glicerol + 13 % sacarose) associados à matriz de alginato de sódio a fim de diminuir a quantidade de água livre e, provavelmente, aumentar o tempo de conservação das gemas apicais encapsuladas.

De acordo com a Tabela 2, verifica-se que o uso de sacarose associado à matriz de alginato proporcionou maiores porcentagens de regeneração das sementes sintéticas. Para ambas as concentrações de sacarose (1 e 3%), a regeneração atingiu média de 60%, após o armazenamento por 7 dias a ± 4° C.

envoltas em cápsulas, contendo apenas meio WPM. Entretanto, não houve regeneração quando utilizou-se a solução A associada à matriz de alginato de sódio.

TABELA 2 Germinação e desenvolvimento in vitro das gemas apicais de mangabeira encapsuladas e conservadas por 7 dias, em temperatura de ±4° C.

* Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem estatisticamente entre si (P<0,05), pelo Teste de Scott-Knott.

Diniz (2004), estudando a produção de sementes sintéticas a partir de gemas apicais de mandioca, afirmou que os propágulos encapsulados podem ser armazenados em geladeira por serem de fácil acomodação, ocupando pouco espaço. Também favorecem a conservação das espécies vegetais, pois podem ser armazenadas sem germinar e não precisam ser repicadas, como nas formas tradicionais de cultivo in vitro.

Quanto ao comprimento das brotações formadas a partir da regeneração das gemas apicais, o número de folhas e a formação de novos brotos não diferiram estatisticamente dentre os tratamentos nos quais adicionou-se a sacarose à matriz de alginato (Tabela 2). Entretanto, visualmente, as brotações provindas do encapsulamento, contendo 1% sacarose apresentaram-se mais vigorosas e com menor quantidade de calos na base dos explantes (Figura 3).

Tratamento Germinação (%) Comprimento da Maior Brotação (cm) Número de Folhas Número de brotações WPM 20 b* 0,55 b 1,20 b 0,30 a 1% Sacarose 60 a 1,32 a 4,60 a 0,50 a 3% Sacarose 60 a 1,03 a 3,40 a 0,50 a Solução A 0 b 0,00 b 0,00 b 0,00 b

FIGURA 3 Aspecto visual das brotações de mangabeira obtidas a partir da regeneração das gemas apicais encapsuladas após armazenamento à temperatura de ± 4° C, por 7 dias. A) cápsula contendo 1% sacarose, com destaque para o aspecto vigoroso dos brotos formados; B) cápsula contendo 3% sacarose.

A regeneração das gemas apicais de mangabeira armazenadas por 15 dias à temperatura de ± 4° C foi de 20% para matriz, contendo apenas meio WPM e 10% quando o açúcar foi incorporado à matriz de alginato. Não houve regeneração das sementes sintéticas quando essas foram armazenadas por 30 dias.

Rady & Hanafy (2004) observaram altas taxas de germinação das gemas apicais encapsuladas de Gypsophila paniculata após armazenamento por 30 dias à temperatura de 4° C. No mesmo trabalho, constatou-se influência da constituição da matriz de encapsulamento com relação à formação de brotos e enraizamento.

Recentemente, açúcares como sacarose, trealose, glucose têm sido utilizados como substâncias crioprotetoras, pois esses apresentam alta eficiência na estabilização de membranas durante a exposição a baixas temperaturas

B A

Entretanto, Bachiri et al. (2000) demonstraram que as células vegetais diferem muito em relação à sua tolerância ao aumento da concentração de sacarose. O que possivelmente poderia estar relacionado ao insucesso do armazenamento das sementes sintéticas, quando a solução A contendo 13%de sacarose foi incorporada à matriz de alginato de sódio. De acordo com Plessis et al. (1991) o aumento progressivo da concentração de sacarose poderia superar esse problema.

Outro aspecto a ser considerado, é o teor de umidade na qual essas sementes sintéticas foram armazenadas (aproximadamente 82%). Testes com diferentes pré-tratamentos e tempos de desidratação das sementes poderiam garantir uma melhor recuperação das gemas apicais após exposição a baixas temperaturas e viabilizar o armazenamento destas por maior intervalo de tempo.

As gemas apicais de mangabeira encapsuladas também foram armazenadas em nitrogênio líquido à temperatura de -196 °C, por 1 hora. Sob essa condição, as reações metabólicas ocorrem muito lentamente ou são totalmente paralisadas (Engelmann, 2004). Teoricamente, o material vegetal pode assim ser armazenado sem qualquer alteração, por um período indefinido de tempo.

Entretanto, não houve regeneração das gemas apicais após exposição à temperatura de -196 °C, independente da constituição da cápsula de alginato utilizada no processo de encapsulamento. Observou-se que as gemas apresentavam coloração verde após descongelamento, porém alguns dias após a inoculação em meio de cultivo estas se encontravam marrons e, aparentemente, mortas (Figura 4).

Resultado semelhante foi encontrado por Verleysen et al. (2004), em que os tecidos viáveis e não viáveis de ápices caulinares criopreservados foram distinguidos através da coloração: os viáveis apresentavam cor verde por

aproximadamente 2 horas e, logo em seguida, tornaram-se escuros devido aos processos de oxidação.

FIGURA 4 Criopreservação de gemas apicais de mangabeira encapsuladas em matriz de alginato de sódio 2,5%. A) após descongelamento; B) cultivadas em meio ½WPMpor 7 dias.

Nos últimos anos, as técnicas de encapsulamento-desidratação e encapsulamento-vitrificação foram desenvolvidas e têm se destacado na criopreservação de ápices caulinares de diversas espécies de plantas tropicais e temperadas (Withers & Engelmann, 1997).

No método de encapsulamento-desidratação, os explantes encapsulados devem ser tratados com alta concentração de sacarose, secas até um teor de umidade de 20-30% (em câmara de fluxo laminar ou sílica gel) e, rapidamente congelados em nitrogênio líquido (Panis & Lambradi, 2005).

De acordo com Santos (2004), este método utiliza a sacarose como crioprotetor combinado com a desidratação parcial das cápsulas antes da exposição ao NL, evitando assim o uso de crioprotetores químicos que podem ser tóxicos para as células vegetais.

Ápices caulinares de videira encapsulados foram pré-cultivados em meio de cultivo suplementado com concentrações crescentes de sacarose (0,25 a 1,0

diferentes períodos de tempos a fim de determinar o tempo ótimo de desidratação das cápsulas (Wang et al., 2000). Esses autores constataram sobrevivência do material apenas quando os ápices caulinares atingiram teor de água inferior a 22,5%.

Neste trabalho, as sementes sintéticas ou sementes encapsuladas de mangabeira foram desidratadas em câmara de fluxo laminar por 1 hora. Entretanto, esse tempo não foi suficiente para uma boa desidratação das cápsulas, uma vez que essas permaneceram com alto teor de umidade durante a criopreservação, inviabilizando sua regeneração (70% de grau de umidade).

Wang et al. (2005) observaram que, cápsulas contendo gemas apicais de Rubus idaeus pré-cultivadas em sacarose continham 66% teor de umidade inicial e que, o conteúdo de água diminuiu para 22,2% nas primeiros 4 h em câmara de fluxo laminar e para 14,3%, após 8 horas de secagem. De acordo com esses autores, as maiores taxas de regeneração das gemas foram obtidas com desidratação de, pelo menos, 3h em fluxo laminar.

A tecnologia de encapsulamento-desidratação tem sido aplicada com sucesso na criopreservação de ápices caulinares em espécies como Beta vulgaris (Vandenbussche & Proft, 1998), Vitis vinifera (Wang et al., 2000), Malus x domestica (Paul et al., 2000), Citrus (Wang et al., 2002), Rubus idaeus (Wang et al., 2005), entre outras. De acordo com esses autores, dentre as vantagens desse método pode-se considerar que a regeneração dos brotos criopreservados é de forma direta e rápida, e normalmente, sem formação de calo.

6 CONCLUSÕES

O emprego do meio WPM associado à matriz de encapsulamento e o meio de cultivo contendo metade da concentração de seus sais favorecem a regeneração de sementes sintéticas de mangabeira.

Adição de 1% ou 3% de sacarose à matriz de alginato de sódio propicia maior tolerância na conservação das sementes sintéticas à temperatura de ± 4° C. Não houve regeneração das gemas apicais de mangabeira encapsuladas após exposição ao nitrogênio líquido (-196° C)

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