CONSIDERAÇÕES FINAIS

O desenvolvimento tecnológico e científico crescente das instituições de ensino e, principalmente das empresas voltadas a produção de materiais para cultivo de células, têm auxiliado os pesquisadores na obtenção de protocolos de isolamento e de culturas mais eficazes. Esses materiais, como as estufas com controle de temperatura e umidade, frascos e meios de cultivo, buscam fornecer um ambiente in

vitro adequado as células, assemelhando-se as condições in vivo, para que essas possam se proliferar e

diferenciar em linhagens celulares específicas.

Nesta revisão observou-se que as células-tronco mesenquimais com potencial reparador podem ser obtidas, isoladas e expandidas de diferentes formas e condições, devido a diversidade dos protocolos de isolamento e cultura existentes. Essa diversidade traz benefícios relacionados ao desenvolvimento de procedimentos que forneçam alto rendimento e viabilidade das células mesenquimais, aumentando assim o número de células finais transplantadas.

Atualmente, o foco “chave” para a elaboração de pesquisas científicas tem sido acerca do mecanismo de diferenciação in vitro das células-tronco cultivadas em laboratório. Para isso, têm-se utilizado em associação substâncias exógenas como os fatores de crescimento, dentre os quais estão às proteínas morfogenéticas ósseas (BMP), fatores de crescimento fibroblásticos (FGF), fatores de crescimento neurotróficos (NGF), e outros.

Espera-se que, no futuro próximo, as vias de sinalização para a diferenciação celular sejam melhor compreendidas, possibilitando o controle, direcionamento e diferenciação em células com capacidade de regenerar tecidos lesados.

4. REFERÊNCIAS

1. AMERSHAM BIOSCIENCES. Ficoll-Paque Plus. For in vitro isolation of

lymphocytes. New Jersey, 2002. 18 p.

2. ASSIS, M.F.L.; SANTOS, E.C.O.; JESUS, I.M.; JESUS, M.I; PINTO, W.V.M.; MEDEIROS, R.L.F.; SILVA, D.F.L. Uso da cultura de células em testes diagnósticos laboratoriais em medicina e biologia. Caderno de Saúde Pública, Rio de Janeiro, v.15, n.3, p.425-432, 2007.

3. AUGUSTI-TOCCO, G.; SATO, G. Establishment of functional clonal lines of neurons from mouse neuroblastoma. Proceeding of the National Academy of Science, Washington, v.64, n.1, p.311–315, 1969.

4. BACSÓ, Z.; EVERSON, R.B.; ELIASON, J.F. The DNA of annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Research, Philadelphia, v.60, n.16, p.4623-4628, 2000.

5. BDBIOSCIENCES. BD Falcon Cell Culture Products. 20p. Disponível em:

www.bdbiosciences.com. Acesso em: 02 ago. 2009.

6. BIANCO, P.; RIMINUCCI, M.; GRONTHOS, S.; ROBEY, P.G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells, Ohio, v.19, n.3, p.180-192, 2001.

7. BIRCH, J.R.; PIRCH, S.J. Improvements in a chemically defined medium for the growth of mouse cells (strain LS) in suspension. Journal of Cell Science, London, v.7, n.3, p.661-670, 1971.

8. BITTENCOURT, R.A.C.; PEREIRA, H.R.; FELISBINO, S.L.; MURADOR, P.; OLIVEIRA, A.P.E.; DEFFUNE, E. Isolamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea. Acta

Ortopédica Brasileira, São Paulo, v.14, n.1, p.22-24, 2006.

9. BOURIN, P.; GADELORGE, M.; PEURAFITTE, J.A.; FLEURY-CAPPELLESSO, GOMEZ, M.; RAGE, C.; SENSEBÉ, L. Mesenchymal progenitor cells: tissue origin, isolation and culture.

10. BOYÜM, A. Isolation of leucocytes from human blood. A two-phase system for removal of red cells with methylcellulose as erythrocyte-aggregating agent. Scandinavian Journal of

Clinical and Laboratory Investigation. Supplementum, Oslo, v.97, p.9-29, 1968.

11. BRUDER, S.P.; KRAUS, K.H.; GOLDBERG, V.M.; KADIYALA, S. The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery, Massachusetts, v.80-A, n.7, p.985-996, 1998.

12. CARR, T.; EVANS, P.; CAMPBELL, S.; BASS, P.; ALBANO, J. Culture of human renal tubular cells: positive selection of kallikrein-containing cells. Immunopharmacology, Amsterdam, v.44, n.1, p.161–167, 1999.

13. COHEN, S.; LEVI-MONTALCINI, R.; HAMBURGER, V. A nerve growth-stimulating factor isolated from sarcom as 37 and 180. Proceeding of the National Academy of Science, Washington,

v.40, n.10, p.1014–1018, 1954.

14. CONNOLLY, J.F. Injectable bone marrow preparations to stimulate osteogenic repair.

Clinical Orthopaedics and Related Research, Philadelphia, v.313, p.8-18, 1995.

15. CONNOLLY, J.F.; GUSE, R.; LIPPIELLO, L.; DEHNE, R. Development of an osteogenic bone-marrow preparation. The Journal of Bone and Joint Surgery, Massachusetts, v. 71A, n.5, p.684-691, 1989.

16. COTTLER-FOX, M.H.; LAPIDOT, T.; PETIT, I.; KOLLET, O.; DI PERSIO, J.F.; LINK, D.; DEVINE, S. Stem cell mobilization. Hematology (American Society of Hematology. Education

Program), p.419-437, 2003.

17. CURY, C.C. Análise das células-tronco mesenquimais da medula óssea de ratos

wistar submetidos á criopreservação. 2005. 70 f. Dissertação (Mestrado em Ciências da

Saúde) – Pontifícia Universidade Católica, Curitiba.

18. DEL CARLO, R.J.; MONTEIRO, B.S.; DAIBERT, A.P.F.; PINHEIRO, L.C.P. Medula óssea autógena. Uma alternativa de enxerto na ortopedia veterinária. Revista Ceres, Viçosa, v.51, n.295, p.411-418, 2004.

19. EAGLE, H. The effect of environmental pH on the growth of normal and malignant cells.

20. EAGLE, H. The specific amino acid requirements of mammalian cells (strain L) in tissue culture. Journal of Biological Chemistry, Maryland, v.214, p.839, 1955.

21. EARLE, D.P.J.; BERLINER, R.W.; TAGGART, J.V.; ZUBROD, C.G.; WELCH, W.J.; BIGELOW, F.S.; KENNEDY, T.J.J.; SHANNON, J.A. Studies on the chemotherapy of the human malarias. X. The suppressive antimalarial effect of paludrine. The Journal of Clinical

Investigation, Michigan, v.27, n.3, p.130-133, 1948.

22. FRIEDENSTEIN, A. J.; PIATETZKY-SHAPIRO, I.I.; PETRAKOVA, K.V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Journal of Embryology and Experimental Morphology, Cambridge, v.16, n.3, p.381-390, 1966.

23. FRESHNEY, R.I. Basic principles of cell culture. Culture of Cells for Tissue

Engineering. Editora John Wiley & Sons, Cap. 1, p.3-22, 2006.

24. FRESHNEY, R.I. Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique. 5 ed. Editora John Wiley & Sons, Nova Jersey, 2005. 672 p.

25. GEY, G.O.; COFFMAN, W.D.; KUBICEK, M.C. Tissue culture studies of the proliferative capacity of cervical carcinoma and normal ephitelium. Cancer Research, Philadelphia, v.12, n.264, p.364-365, 1952.

26. HAM, R.G. Clonal growth of mammalian cells in a chemically defined synthetic medium.

Proceeding of the National Academy of Science, Washington, v.53, p.288, 1965.

27. HAYFLICK, L.; MOORHEAD, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains.

Experimental Cell Research, Stockholm, v.25, p.585-621, 1961.

28. HAYASHI, I.; SATO, G. Replacement of serum by hormones permits growth of cells in defined medium. Nature, London, v.259, p.132-134, 1976.

29. HÖPPNER, M.; LUHM, J.; SCHLENKE, P.; KORITKE, P.; FROHN, C. A flow-cytometry based cytotoxity assay using stained effector cells in combination with native targel cells. Journal

of Immunological Methods, Missouri, v.267, n.2, p.157-163, 2002.

30. HU, Y.; LIAO, L.; WANG, Q.; MA, L.; MA, G.; JIANG, X.; ZHAO, R.C. Isolation and identification of mesenchymal stem cells from human fetal pancreas. Journal of Laboratory and

31. HUANG, C.; KRISTEN, L.H.; FROST, L.E.; SUN, Y.; CHEUNG, H.S. Effects of cyclic compressive loading on chondrogenesis of rabbit bone-marrow derived mesenchymal stem cells.

Stem Cells, Ohio, v.22, n.3, p.313-323, 2004.

32. HUANG, J.I.; KAZMI, N.; DURBHAKULA, M.M.; HERING, T.M.; YOO, J.U.; JOHNSTONE, B. Chondrogenic potential of progenitor cells derived from human bone marrow and adipose tissue: A patient-matched comparison. Journal of Orthopedic Research, New Jersey, v.23, n.6, p.1383-1389, 2005.

33. IM, G.I.; KIM, D.Y., SHIN, J.H.; HYUN, C.W.; CHO, W.H. Repair of cartilage defect in the rabbit with cultured mesenchymal stem cells from bone marrow. The Journal of Bone and Joint

Surgery, Massachusetts, v.83-B, n.2, p.289-294, 2001.

34. ISLAM, A. A new, fast and convenient method for layering blood or bone marrow over density gradient medium. Journal of Clinical Pathology, Londres, v.48, n.7, p.686-688, 1995.

35. JAVAZON, E.H.; BEGGS, K.J.; FLAKE, A.W. Mesenchymal stem cells: paradoxes of passaging. Experimental Hematology, Copenhagen, v.32, n.5, p.414-425, 2004.

36. JONES, E.A.; KINSEY, S.E.; ENGLISH, A.; JONES, R.A.; STRASZYNSKI, L.; MEREDITH, D.M.; MARKHAM, A.F.; JACK, A.; EMERY, P.; MCGONAGLE, D. Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells. Arthritis e

Rheumatism, New Jersey, v.46, n.12, p.3349-3360, 2002.

37. KAPLAN, J.; NOLAN, D.; REE, A. Altered lymphocyte markers and blastogenic responses associated with 24 hour delay in processing of blood samples. Journal of

Immunological Methods, Missouri, v.50, n.2, p.187–191, 1982.

38. KIRSCHSTEIN, R. Stem cells: scientific progress and future research. Bethesda: The Nacional Institute of Health. Department of Health and Human Services. 2001.

39. KOHLER, G.; MILSTEIN, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, New York, v.256, n.5517, p.495–497, 1975.

40. KRAUS, K. H.; KIRKER-HEAD, C. Mesenchymal stem cells and bone regeneration.

Veterinary Surgery, Philadelphia, v. 35, n.3, p. 232-242, 2006.

41. LEE, M.S.; LILL, M.; MAKKAR, R.R. Stem cell transplantation in myocardial infarction.

42. MASCOTTI, K.; McCULLOUGH, J.; BURGER, S.R. HPC viability measurement: trypan blue versus acridine orange and propidium iodide. Transfusion, Massachusetts, v.40, n.6, p.693- 696, 2002.

43. MATHER, J.P.; ROBERTS, P.E. Introduction to cell and tissue culture: theory and

technique. Plenum, New York, 1998. 241p.

44. MINGUELL, J.J.; CONGET, P.; ERICES, A. Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, São Paulo, v.33, n.8, p.881-887, 2000.

45. NAKAGE, A.P.M.; SANTANA, A.E.; CÁPUA, M.L.B.; GODOY, A.V. Quantificação de células CD34+ do sangue do cordão umbilical de cães. Ciência Rural, Santa Maria, v.39, n.2, p.434-441, 2009.

46. NISHIMORI, M.; DEIE, M.; KANAYA, A.; EXHAM, H.; ADACHI, N.; OCHI, M. Repair of chronic osteochondral defects in the rat. A bone marrow-stimulating procedure enhanced by culture allogenic bone marrow mesenchymal stromal cells. The Journal of Bone and Joint

Surgery, Massachusetts, v.88B, n.9, p.1236-1244, 2006.

47. OLIVEIRA, B.J.N.A. Enxerto osteocondral alógeno, associado á inoculação de

células mononucleares da medula óssea e proteína morfogenética óssea no reparo do sulco troclear de coelhos. 2009. 53 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) –

Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia.

48. OLIVEIRA, B.J.N.A.; STEFANES, S.A.; JACOBINA, G.C.; FARIAS, A.; ALMEIDA, R. M. Auto-enxerto percutâneo de medula óssea no processo de consolidação de fraturas de fêmur. In:

Anais do III Concevepa, Brasília, p.88-90, 2006.

49. OLSSON, D.C.; PIPPI, N.L.; MARTINS, D.B.; TOGNOLI, G.K.; SANTOS JÚNIOR, E.B.; MULLER, D.C.; LOPES, S.T.A.; MARCONATO, F.; MÖRCHBÄCHER, P.D.; TEIXEIRA, L.V. Colheita de medula óssea em cães: modelo para obtenção da fração total de células mononucleares. Ciência Rural, Santa Maria, v.39, n.1, p.141-147, 2009.

50. PALERMO, A.T.; LABARGE, M.A.; DOYONNAS, R.; POMERANTZ, J.; BLAU, H.M. Bone marrow contribution to skeletal muscle: a physiological response to stress. Developmental

51. PEREIRA, I.S.O.; PONTES, P.; EÇA, L.P.; FERREIRA, A.T.; MAZZETTI, P.M.V.; SILVA, L.; SOUZA, F.C. Protocolo piloto de separação e quantificação de células tronco de tecido adiposo de coelhos para posterior uso em laringe. Acta ORL, São Paulo, v.26, n.3, p.11-16, 2008.

52. PERPER, R.J.; ZEE, T.W.; MICKELSON, M.M. Purification of lymphocytes and platelets by gradient centrifugation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, New York, v.72, n.5, p.842–848, 1968.

53. PHELAN, M.C. Current Protocols in Cell Biology. Ed. John Wiley & Sons, cap. 1, p.1- 10, 2006.

54. POUNTOS, I.; GIANNOUDIS, P.V. Biology of mesenchymal stem cells. Injury, New York, v.36, n.3, p.8-12, 2005.

55. PRETLOW, T.G.; PRETLOW, T.P. Cell separation by gradient centrifugation methods.

Methods in Enzymology, New York, v.171, p.462–482, 1989.

56. PROCKOP, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.

Science, Pennsylvania, v.276, n.5309, p.71-74, 1997.

57. PROCKOP, D.J.; GREGORY, C.A.; SPEES, J.L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National

Academy of Science of the United States of America, v.100, n.1, p.11917-11923, 2003.

58. REYNA, M. Técnicas de estudio de líneas celulares [online]. Universidad de Barcelona, 2003. Disponível:http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas _de_cultivo celular.htm. Acesso em: 30 ago. 2009.

59. SAALBACH, A.; AUST, G.; HAUSTEIN, U.F.; HERRMANN, K.; ANDEREGG, U. The fibroblast specific MAb AS02: A novel tool for detection and elimination of human fibroblasts. Cell

and Tissue Research, New York, v.290, n.3, p.593–599, 1997.

60. SALAMA, R.; WEISSMAN, S.L. The clinical use of combined xenografts of bone and autologous red marrow. The Journal of Bone and Joint Surgery, Massachusetts, v. 60 B, n. 1, p.111-115, 1978.

61. SCHWINDT, T.T.; BARNABÉ, G.F.; MELLO, L.E.A.M. Proliferar ou diferenciar? Perspectivas de destino das células-tronco. Jornal Brasileiro de Neurocirurgia, Rio de Janeiro, v.16, n.1, p.13-19, 2005.

62. SÖNDAHL, M. R.; SHARP, W. R. High frequency induction of somatic embryos in cultured leaf explants of Coffea arabica L. Zeitschrilt Pflanzenphysiologie, Stuttgart, v.81, p.395-408, 1977.

63. SOUZA, L.A. Enxerto osteocondral alógeno, associado á inoculação de células

mononucleares autólogas da medula óssea no reparo do sulco troclear de coelhos. 2009.

67 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) – Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia.

64. STRAUER, B.E.; KORNOWSKI, R. Stem cells therapy in perspective. Circulation, Massachusetts, v.107, p.929-934, 2003.

65. SUTER, S.E.; GOUTHRO, T.A.; MCSWEENEY, P.A.; NASH, R.A.; HASKINS, M.E.; FELSBURG, P.J.; HENTHORN, P.S. Isolation and characterization of pediatric canine bone marrow CD34+ cells. Veterinary Immunology and Immunopathology, Amsterdam, v.101, n.1- 2, p.31-47, 2004.

66. TIEDEMAN, J.J.; CONNOLLY, J.F.; STRATES, B.S.; LIPPIELLO, L. Treatment of nonunion by percutaneous injection of bone marrow and demineralized bone matrix an experimental study in dogs. Clinical Orthopaedics and Related Research, v. 268, p.294-302, 1991.

67. TOGNOLI, G.K.; PIPPI, N.L.; OLSSON, D.C.; GRAÇA, D.L.; TRAEZEL, C.K.; LOPES, S.T.A.; MARTINS, D.B.; RAISER, A.G.; MAZZANTI, A. Isolamento, quantificação e viabilidade da fração total de células mononucleares da medula óssea em cães. Acta Scientiae Veterinariae, Porto Alegre, v.35, n.2, p.368-369, 2007.

68. VERFAILLIE, C.M. Adult stem cells: assessing the case for pluripotency. Trends in Cell

Biology, Cambridge, v.12, n.11, p.502-508, 2002.

69. VIVES, J.; PARRA, M.; CASTILLO, R. Platelet aggregation technique used in the preparation of lymphocyte suspensions. Tissue Antigens, Melbourne, v.1, n.6, p.276–278, 1971.

70. WEXLER, S.A.; DONALDSON, C.; DENNING-KENDALL, P.; RICE, C.; BRADLEY, B.; HOWS, J.M. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal stem cells but umbilical

cord and mobilized adult blood are not. British Journal of Haematology, London, v.121, n.2, p.368-374, 2003.