CONSIDERAÇÕES FINAIS

O acúmulo de sacarose em cana de açúcar é um mecanismo complexo que envolve sinalização e regulação de genes e proteínas envolvidos na via de metabolismo de carboidratos.

Análises de expressão gênica entre as variedades RB855156 e RB935744 de cana de açúcar mostraram que o gene ScUGPase-1 é mais expresso nos colmos do que em folhas, e sua expressão diminui ao longo da maturação dos entrenós. A inibição da expressão gênica pode ser causada pela concentração dos produtos catalisados pelas enzimas da via de biossíntese da sacarose. A sacarose, UDP-Glc, Glc-1-P e Pi também podem exercer um efeito de feedback negativo na atividade da proteína UGPase de plantas. Outros mecanismos como fosforilação, oligomerização e interação protéica podem exercer um controle sobre a via de biossíntese de sacarose.

A síntese de sacarose durante a fotossíntese está ligada às taxas de fixação de dióxido de carbono no tecido fonte decorrente da regulação coordenada da atividade das enzimas futose-1,6- bifosfatase e sacarose fosfato sintase. A sacarose fosfato sintase é ativada na presença de luz por mudanças nos níveis do seus substratos UDP-Glc e Fru-6-P e efetores alostéricos Glc-1-P e Pi, bem como pela defosforilação de uma serina, resultando no aumento da atividade da proteína frutose-1,6-bifosfatase. Observamos que a proteína ScUGPase-1 é fosforilada in vivo em folha, e sua atividade pode estar associada à atividade da proteína SPS no tecido fonte. Se a taxa de síntese de sacarose exceder a capacidade do tecido fonte de exportar ou estocar sacarose, isso pode levar a uma inibição por feedback negativo da síntese de sacarose. À medida que a atividade da sacarose fosfato sintase diminui, devido a uma mudança no seu estado de

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fosforilação, ocorre um acúmulo de hexoses e um aumento na síntese de frutose-2,6-bifosfato, no qual inibe a proteína frutose-1,6-bifosfatase. A inibição da síntese de sacarose restringe a concentração de Pi no citoplasma, resultando na diminuição da exportação da triose-6-fosfato do cloroplasto para o citoplasma. Dessa forma, a síntese de sacarose não é coordenada apenas pela fotossíntese, mas pela demanda de fotoassimilados por parte do tecido dreno.

No tecido dreno, observamos que a proteína ScUGPase-1 está presente no citoplasma e na fração microssomal. Considerando que a UDP-glucose não é apenas utilizada na via de síntese de sacarose, mas também na biossíntese da parede celular, a ScUGPase-1 associada à membrana pode produzir UDP-glucose para a celulose sintase e/ou calose sintase em conjunto com a proteína SuSy. A SuSy é ativa em seu estado defosforilado nos entrenós imaduros, sendo que sua atividade é negativamente correlacionada com o conteúdo de sacarose e positivamente correlacionada com os níveis de hexose (Verma et al., 2011). Os mecanismos que regulam a biossíntese da parede celular e a relação fonte-dreno em cana de açúcar podem ser constituintes importantes para alterar a partição de carbono entre fibras e açúcar nos colmos.

Outro aspecto importante é a oligomerização como um mecanismo de controle da atividade de proteínas da via de síntese de carboidratos. Em Entamoeba histolystica, a atividade da proteína UGPase é modulada por agentes óxido-redutores (Martinez et al., 2011). A ADP- glucose pirofosforilase é uma proteína hetero-tretamérica da família das pirofosforilases que catalisa a produção de ADP-glucose, e que também tem sua atividade e estado oligomérico modulados via óxido-redução.

Os ensaios de cinética enzimática in vitro mostraram que a atividade da proteína ScUGPase-1 foi regulada pela adição de H2O2 e DTT.

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Para complementar esses dados, propusemos um experimento de espalhamento de luz a baixo ângulo (SAXS) com o intuito de avaliar em quais condições experimentais seria possível observar a transição do estado monomérico para o estado dimérico da proteína ScUGPase-1.

Os dados de SAXS coletados indicam que a proteína ScUGPase-1 encontra-se na forma de monômeros e dímeros em solução, em diferentes condições, não havendo alteração significativa com mudanças de concentração protéica ou condição redutora do meio.

Na estrutura da proteína UGPase de A. thaliana (PDB 1Z90), a unidade assimétrica do cristal contém dois monômeros, indicados pelos autores da estrutura como sendo o dímero funcional em solução que resulta na redução da atividade da proteína por ocluir o sítio ativo dos monômeros. Entretanto, o artigo não apresenta evidências experimentais em solução para suportar essa conclusão. No caso da estrutura da proteína UGPase de S. cerevisiae (PDB 2IK5), os autores escolheram um outro dímero para a unidade assimétrica, também formado por dois monômeros, porém em uma configuração diferente, que resulta em uma distância máxima de 137 Å. Curiosamente, esta configuração também poderia ser adotada no caso da estrutura 1Z90. Aparentemente, apesar da ausência de evidência em solução, os autores selecionaram a outra configuração pelo fato dela contribuir de forma mais simples para o estabelecimento de um modelo de regulação da atividade da proteína.

Nossos dados sugerem que, em solução, a configuração da proteína UGPase é distinta dessa inicialmente prevista em A. thaliana, com uma interface de dimerização localizada na região C-terminal. Em um estudo anterior, a expressão heteróloga da proteína mutante UGPase de cevada, com uma deleção nos oito últimos aminoácidos da região C-terminal, resultou em uma maior atividade da proteína mutante quando comparada com a proteína selvagem. Somado a

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isso, em solução, a proteína mutante apresentou-se basicamente na forma monomérica (Meng et al., 2009, Kleczkowski et al., 2005). Esses dados sugerem que a região C-terminal tem um papel importante na regulação da atividade da proteína UGPase, estabilizando a estrutura octamérica da proteína de levedura e permitindo a formação de dímeros e oligômeros da proteína UGPase de plantas. Especulamos que sob condições de estresse gerados por espécies reativas oxigênio (ROS), a proteína UGPase pode sofrer uma modificação pós-traducional reversível chamada S- glutationilação, considerado um mecanismo de proteção para prevenir a oxidação irreversível de cisteínas reativas ao ácido sulfênico e seus derivados na presença de H2O2. Cisteínas oxidadas

formam pontes dissulfeto com glutationas presentes no meio intracelular para evitar degradação protéica. Isso pode ser visto no trabalho de Dixon e colaboradores, (2005), que observaram que a proteína UGPase de A. thaliana foi tiolada com glutationas conjugadas com biotina (Dixon et al., 2005).

Os dados apresentados mostram a complexidade da biossíntese e acúmulo de sacarose em cana de açúcar e fornece subsídios para a compreensão dos mecanismos regulatórios que controlam a atividade da proteína UDP-glucose pirofosforilase.

8. CONCLUSÕES

 Análises de expressão gênica entre as variedades RB855156 e RB935744 de cana de açúcar mostraram que o gene ScUGPase-1 é mais expresso nos colmos do que em folhas, e sua expressão diminui ao longo da maturação dos entrenós.

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 Através da técnica His-tag Pull-Down, confirmamos, in vitro, que a interação entre as proteínas selvagem ScUGPase-1-His e mutante ScUGPaseS419 com a proteína AtCK1- FLAG é dependente de magnésio.

 Nossos resultados de fracionamento celular perimitiram identificar que a proteína ScUGPase-1 encontra-se associada à membrana nos tecidos de folha e entrenó in vivo; porém sua fosforilação ocorre apenas na fração solúvel e microssomal do tecido de folha.

 Os ensaios de cinética enzimática in vitro na presença de H2O2 ou DTT mostraram que a

atividade da proteína ScUGPase-1 é modulada através de óxido-redução.

 Os dados de SAXS indicam que a proteína ScUGPase-1 encontra-se na forma de monômeros e dímeros em solução, em diferentes condições, não havendo alteração significativa com mudanças de concentração protéica ou condição redutora do meio.

 Nossos dados sugerem que, em solução, a configuração da proteína UGPase é distinta da inicialmente prevista em A. thaliana, com uma interface de dimerização localizada na região C-terminal.

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