Ligantes
1) Foram sintetizados quatro novos ligantes binucleantes, a saber, HL1 (do tipo simétrico heptadentado), HL2 (não-simétrico heptadentado), H2L3 e H2L4 (hexadentados não-
simétricos). Todos esses compostos, com exceção de H2L4, possuem a função imina
em suas estruturas. HL1 e HL2 não foram isolados, isto é, foram gerados no próprio meio em que seriam posteriormente utilizados. Os ligantes H2L3 e H2L4, por sua vez,
foram isolados com rendimentos satisfatórios e caracterizados através de seus pontos de fusão, análise elementar e espectroscopias vibracional (IV) e eletrônica (UV-vis). Foi realizado ainda um estudo que possibilitou atribuição total dos espectros de RMN de 1H e 13C desses compostos. Cristais adequados para a determinação estrutural pela técnica de difração de raios-X foram obtidos em ambos os casos e, assim, as estruturas dos dois ligantes puderam ser determinadas.
Complexos
2) A partir desses ligantes, três complexos binucleares de cobre(II) inéditos, todos eles contendo uma ponte -hidroxo entre os metais, foram preparados e caracterizados por análise elementar, espectroscopias vibracional e eletrônica, EPR, medidas magnéticas, eletroquímica (voltametria cíclica e de onda quadrada) e condutimetria. Os compostos em questão são: [Cu2( -OH)(L1)](ClO4)2·H2O (1), [Cu2( -OH)(L2)(ClO4)]ClO4 (2) e
[Cu2( -OH)(L3)]ClO4 (3). Os três tiveram as suas estruturas elucidadas por difração
de raios-X em monocristal. Caberia destacar aqui que não são muitos os complexos de cobre contendo simultaneamente pontes -hidroxo e -fenoxo descritos na literatura. Além disso, a presença da ponte -hidroxo torna esses compostos excelentes modelos estruturais para a forma met do sítio ativo das metaloenzimas catecol oxidases (21,22). Os sistemas constituídos por 1 e 2 e suas formas protonadas e desprotonadas foram também caracterizados via titulações potenciométricas e espectrofotométricas, o que forneceu informações de grande utilidade na identificação das espécies cataliticamente ativas. Um fato bastante curioso reside nas dificuldades enfrentadas durante as várias tentativas de isolamento do complexo contendo o ligante hexadentado H2L4: todas as
reações resultaram na obtenção da espécie [Cu2( -OH)(L3)]ClO4 (3), o que sugere que
a amina aromática secundária presente em H2L4 seja oxidada à correspondente imina
Atividade de Catecolase
3) Estudos da reatividade desses compostos na reação de oxidação do substrato modelo 3,5-dtbc demonstraram que 1 e 2 são capazes de catalisar a mesma, podendo ser então considerados modelos funcionais para as catecol oxidases. O melhor desempenho foi obtido pelo complexo 2, que apresentou, para a reação a 25,0 ºC, kcat = 6,25 x 10-3 s-1 e
uma eficiência catalítica kcat / KM de 2,31 L mol-1 s-1. Em ambos os casos, as espécies
ativas na catálise são aquelas de tipo -hidroxo, caracterizadas cristalograficamente. Com base nessas informações, propôs-se um mecanismo para a reação promovida por 1 e 2, o qual envolve uma coordenação final do substrato 3,5-dtbc ao catalisador no modo - 2: 1. O composto 3, por outro lado, mostrou-se completamente inativo, o que pode estar relacionado com o elevado valor da diferença entre E½ e Epc para os
seus centros de cobre ( E = 0,70 V, o maior dentre os três complexos sintetizados).
Atividade de Fosfatase
4) A presença de um potencial nucleófilo (a saber, o ligante exógeno hidroxo coordenado em ponte) nas estruturas dos compostos 1, 2 e 3, serviu como incentivo à realização de testes catalíticos frente à reação de hidrólise do diéster de fosfato ativado BDNPP. Todos os três complexos, de fato, demonstraram ser ativos. Novamente, 2 foi aquele que apresentou a maior atividade, com uma constante catalítica kcat = 1,93 x 10-4 s-1 e
kcat / KM de 2,17 x 10-2 L mol-1 s-1 a 50,0 ºC, o que representa uma taxa de aceleração
de ~500 vezes em relação à velocidade de hidrólise da reação não-catalisada. Para o caso específico de 1 e 2, que possuem também atividade de tipo oxidativa (conforme descrito no parágrafo anterior), a mencionada atividade hidrolítica os transforma num interessante e raro exemplo de promiscuidade catalítica em sistemas biomiméticos. Entretanto, pelo perfil de dependência em relação ao pH observado, é possível se inferir que as espécies cataliticamente ativas não são as mesmas nos sistemas 1 e 2. Para este último, propõe-se uma espécie poli-hidroxilada como principal responsável pela catálise. Foi feito ainda um estudo envolvendo cálculos teóricos em fase gasosa para o composto 1, utilizando-se a teoria do funcional de densidade (DFT). A partir deste trabalho, foi possível se atribuir o modo de coordenação do BDNPP ao cátion complexo presente em 1 como sendo do tipo monodentado a apenas um dos centros cúpricos. Isto traz importantes implicações mecanísticas (coordenação monodentada
do substrato e subseqüente ataque por um nucleófilo que faz ponte entre os metais), levando à proposição de um ciclo catalítico completamente inédito para a reação.
Clivagem de DNA Plasmidial
5) Em virtude da atividade hidrolítica apresentada pelos compostos 1, 2 e 3 frente ao substrato modelo BDNPP, foram realizados testes visando avaliar o efeito que esses complexos poderiam causar nos ácidos nucléicos (mais especificamente, sobre o DNA plasmidial pBSKII). Observou-se que os três compostos possuem atividade nucleásica diretamente correlacionada à concentração para todos os pHs testados na faixa 6,0-8,0, o que os torna verdadeiras nucleases químicas. A ordem de reatividade foi 2 > 1 > 3. O mais ativo deles, 2, apresentou uma taxa de aceleração de 31 milhões de vezes! sobre a velocidade da reação não-catalisada. É importante salientar que os complexos 1 e 2 mostraram ainda capacidade de linearização do DNA, o que sugere a existência de certa especificidade sítio-dirigida na clivagem e faz desses dois compostos sérios candidatos a ferramentas biotecnológicas.
Ensaios em Células Tumorais e Macrófagos
6) Finalmente, pela sua capacidade de ocasionar danos ao DNA, o efeito citotóxico dos complexos 1 e 2 (aqueles que apresentaram maior atividade) foi testado em células de leucemia mielóide crônica pertencentes à linhagem K562. Ambos os compostos foram ativos, com 1 apresentando uma maior citotoxicidade (CI50 de 44,70 mol L-1). Este
resultado é, a princípio, surpreendente, já que o complexo 2 mostrou-se mais eficiente tanto nos testes oxidativos quanto nos de clivagem do DNA. Ensaios de acumulação celular indicaram que 1 e 2 são incorporados de forma muito efetiva nas células da linhagem K562, com concentrações intracelulares ~450 e 290 vezes maiores do que as extracelulares, respectivamente! Para avaliar-se o efeito do composto 1 em células normais, testes de viabilidade celular foram realizados com macrófagos peritoneais inflamatórios. Verificou-se que, a concentrações em que 1 já é tóxico para as células de leucemia, ele não afeta de forma significativa os macrófagos. Os resultados obtidos indicam então que o complexo apresenta seletividade em relação às células tumorais e, portanto, constitui um composto promissor para a realização de testes futuros.