Considerações sobre a eletroforese em gel

Devido à complexidade das amostras biológicas, é geralmente necessário separar os analitos antes da análise no espectrômetro de massas, a fim de que a complexidade do que é introduzido no equipamento seja compatível com o desempenho do instrumento no modo de medição escolhido[1]. Esta separação pode ser feita nas proteínas da amostra ou nos peptídeos resultantes da digestão das proteínas (ou ambos). Como analitos, as proteínas são muito mais complexas que os peptídeos, mas também muito mais fáceis de separar, diferindo muito em tamanho, ponto isoelétrico e hidropatia [1,2]. A espinha dorsal polipeptídica das proteínas é muito menos importante se comparada com as cadeias laterais de aminoácidos, e o comportamento físico-químico das proteínas é extremamente complexo e depende da composição e sequência de cada proteína. Ainda, esta complexidade leva à formação da estrutura tridimensional das proteínas, induzindo

uma química de superfície complexa, pois as proteínas apresentam superfícies com várias características (catiônica, aniônica, hidrofóbica)[2,3 ].

Entre os vários modos de separação disponíveis para proteínas e peptídeos, cromatografia e eletroforese são quase que exclusivamente usados nos dias de hoje.

Como o nome diz, a eletroforese em gel consiste em realizar a separação em um gel condutor, ou seja, um polímero com poros de tamanho aproximadamente definidos. Historicamente falando, a eletroforese em sua forma moderna nasceu na década de 1970, quando Laemmli[4] associou o alto poder de resolução do sistema utilizado previamente ao conhecido poder desnaturante do SDS, que já era usado em menores concentrações na eletroforese. Este método se mostrou extremamente versátil, e seu uso foi difundido rapidamente.

As cadeias poliméricas que delimitam os poros do gel limitam a difusão, o que por sua vez aumenta a resolução [1]. Por fim, a fricção dos analitos no material do gel adiciona outro parâmetro de separação que pode ser usado para aumentar a resolução da técnica, especialmente quando o tamanho do analito é o parâmetro de separação[1, 2]. O preço a se pagar com o uso de gel é a perda da automação, mas esta perda é compensada em parte pelo fato de que a separação no gel é contínua e pode ser paralela, com várias amostras por gel no caso da separação unidimensional, ou promover um processo bidimensional contínuo [1, 5].

Os géis devem ter poros de tamanho adequado e que possam ser modificados. Mais importante os géis não devem conter cargas elétricas que poderiam complicar ou perturbar as separações e não devem também adsorver proteínas, pois isso causaria um arraste nas separações. Também devem ser resistentes a solventes orgânicos usados em procedimentos de lavagem, digestão e extração das proteínas que serão analisadas no espectrômetro de massas. Esta série de restrições confinaram os géis usados em eletroforese a poliacrilamida. Devido à sua natureza, este polímero é estável em muitas situações adversas [1,2].

Em quase todos os esquemas proteômicos onde a separação das proteínas é feita por eletroforese em gel, a SDS-PAGE é encontrada. Esta pode ser usada como único modo de separação, mas, também, pode ser usada em conjunto com outros processos de separação, tais como eletroforese nativa, cromatografia de troca iônica, eletroforese denaturante, e focalização isoelétrica (constituindo a 2D- PAGE). O SDS apresenta um compromisso de sucesso entre hidrofobicidade e hidrofilicidade, e se liga muito bem a quase todas as proteínas. Além de promover a desnaturação de proteínas, confere a elas uma carga negativa forte, mascarando suas cargas nativas.

Na SDS-PAGE, a migração é medida no gel comparada com a migração de uma frente de íons pequenos, visualizada com o corante. Por causa da grande distribuição de tamanhos das proteínas, é interessante otimizar essa resolução de acordo com as necessidades experimentais. A resolução é mudada principalmente trocando-se o tamanho do poro do gel de separação, e, portanto, a concentração de acrilamida. Quando os géis possuem baixa concentração de acrilamida, a migração das proteínas de baixa massa molar é realizada com facilidade pelo gel, e correrão quase ao mesmo tempo em que a frente de íons pequenos que demarca a corrida. Enquanto isso, as proteínas de maior massa molar apresentam mais dificuldade para permear os poros do gel, o que pode resultar em maior separação entre elas. Ao contrário, se a concentração do gel aumentar, as proteínas de baixa massa molar vão migrar mais lentamente que os íons pequenos que demarcam a frente de corrida, e estarão mais separadas umas das outras, enquanto muitas das proteínas de maior massa molar serão incapazes de permear na matriz polimérica, e irão permanecer próximos da borda do gel, com quase nenhuma separação. Um bom compromisso é utilizar um gradiente de concentração de acrilamida, porém existem alguns problemas quando se usa esta estratégia como, por exemplo, os géis de baixa concentração podem não apresentar consistência adequada, enquanto géis com altas concentrações podem quebrar facilmente, limitando a otimização da resolução[1,2].

Apesar de suas ótimas capacidades em termos de solubilização de proteínas, versatilidade e flexibilidade, a SDS-PAGE, sozinha, não tem resolução para ser

usada com única técnica de separação em proteômica, e deve ser acompanhada de outras técnicas de separação, que podem ser realizadas antes ou após a eletroforese em gel. Entretanto, quando racionalizando as possíveis escolhas, deve-se levar em conta que as proteínas desnaturadas com SDS são solúveis na presença do SDS, porém, podem se tornar facilmente insolúveis quando este reagente é removido. Portanto, quase sempre, as outras separações protéicas são realizadas em etapa prévia à eletroforese em gel[1,2].