CONSIDERAÇÕES SOBRE OS INICIADORES E AMPLIFICAÇÃO DO DNA DO VHB

Na detecção do VHB por meio de técnicas de biologia molecular, a escolha dos primers a serem utilizados caracteriza-se no passo crítico do estudo, uma vez que é necessário o uso de iniciadores capazes de detectar os múltiplos genótipos e variantes do VHB. Com isso, optou-se por usar dois pares de iniciadores (HBV1 e 2 / HBV3 e 4) que fossem específicos para o maior número possível de genótipos do VHB, com a finalidade de confirmar os resultados obtidos. Não foi observada homologia dos iniciadores com sequências de outros organismos que não o VHB.

Sabe-se que o padrão ouro atual para a detecção do VHB oculto é a análise do DNA viral pela técnica de nested-PCR ou PCR em tempo real.Entretanto, é importante ressaltar que os níveis séricos de DNA viral (<200UI/mL) em casos de HBO são muitas vezes inferiores ao limite de detecção de certos ensaios quantitativos(MELLO, 2007; HOLLINGER E SOOD, 2010).Sendo assim, a escolha da metodologia de análise deve ser bem criteriosa a fim de evitar resultados falso-negativos.

A metodologia escolhida pelo estudo foi a nested-PCR pelo fato do NGHM-UFES já estar equipado com todo o aparato laboratorial para a realização do projeto e também pelo baixo custo da técnica.

Em todas as reações realizadas no decorrer do estudo foi possível a amplificação do controle positivo,mostrando que a nested-PCR é uma técnica segura e confiável, que produz resultados satisfatórios utilizando-se de um pequeno volume amostral.

Quanto ao par de primersHBV1 e 2 optou-se por manter a visualização do borrão, ao invés da banda bem delimitada com o objetivo de detectar a Hepatite B Oculta, a qual caracteriza-se pela presença do VHB em baixa viremia.Dessa forma, entende-se que quanto menor a carga viral, menor será a saturação no gel e consequentemente menos

poliacrilamida. Então, mantendo a visualização do borrão existe uma maior possibilidade de se detectar amostras VHB positiva com baixa carga viral.

No estudo, o controle VHB positivo com menor carga viral apresentava 14UI/mL. Na amplificação de tal amostra foi possível a visualização do borrão, indicando assim a possibilidade de detecção de amostras com cargas virais menores que 14UI/mL.

Quanto ao par de primers HBV3 e 4, embora haja a visualização da banda de interesse e de bandas inespecíficas, optou-se pela permanência e manutenção das mesmas para não diminuir a sensibilidade da reação, de forma a não diminuir a saturação da banda de interesse. A ausência de tais bandas em amostras HBsAg negativas também representou um fator determinante na permanência das bandas inespecíficas.

5.2.1 CONSIDERAÇÕES SOBRE A DETECÇÃO DO VHB OCULTO

A detecção do VHB oculto em 1/520 (0,2%) amostras de doadores de sangue foi possível com a utilização do par de primers HBV1 e 2, porém, não foi possível confirmar o resultado em uma nova amplificação. A fim de excluir-se o erro humano, tal amostra foi novamente extraída e re-amplificada, entretanto, o resultado permaneceu negativo. Posteriormente, tentou-se amplificar o VHB oculto com o par de primers HBV3 e 4 e, novamente não foi obtido sucesso na amplificação.

Sendo assim, entende-se que a impossibilidade de re-detecção do VHB oculto em 1/520 amostras analisadas, possivelmente, foi devido à degradação do DNA.

Estudos sobre a degradação do DNA extraído, armazenado em diferentes temperaturas (-20°C, -4°C e 27°C) revelam que há degradação da amostra independente da temperatura de armazenamento, embora em diferentes graus (amostras armazenadas em temperaturas mais baixas apresentam menor índice de degradação) (ALMEIDA et al., 2009).

Na realização do estudo, as alíquotas sanguíneas coletadas foram centrifugadas e, armazenou-se apenas o plasma em freezer a -18°C. Deixados transcorrer um período de dois meses para finalizar a coleta, iniciou-se o processo de extração de DNA. Ao

final de cada processo de extração, as amostras eram armazenadas em geladeira a - 4°C.

Após o período de um mês, iniciou-se o processo de amplificação quando foi possível detectar o VHB oculto em 1/520 amostras analisadas.

Outro fato interessante a ser ressaltado envolve um caso peculiar na amplificação dos controles VHB positivo. A amostra uma vez extraída e eluída em 20µL de LoTE não deve ser usada até finalizar o seu volume. Ao gastar-se aproximadamente metade do volume estocado, a amostra começa a perder a positividade.

Diante do exposto entende-se que a impossibilidade de re-detecção do VHB oculto deve estar possivelmente relacionada com a forma de armazenamento do plasma, com o tempo prolongado entre coleta e amplificação, bem como com a baixa viremia do VHB em casos de HBO. Sendo assim sugere-se que a alíquota sanguínea, assim que coletada seja processada (extração e amplificação), ou então, que seja armazenada em nitrogênio líquido a temperaturas extremamente baixas, evitando assim a degradação do pouco material viral encontrado no plasma.

5.2.1.1 CONSIDERAÇÕES SOBRE O SEQUENCIAMENTO DO VHB OCULTO E CONTROLES VHB POSITIVO DA PCR

Para excluir-se a hipótese de contaminação e garantir que a amostra positiva p58 realmente enquadra um caso de Hepatite B Oculta sequenciou-se 8/10 amostrasVHB positivas armazenadas no laboratório e utilizadas no estudo. Não foi possível sequenciar2/10 controles positivos pois o volume amostral estocado era insuficiente para a realização do procedimento.

É importante ressaltar que o controle positivo utilizado na reação em que se detectou o VHB oculto foi novamente extraído e sequenciado para assim garantir a fidelidade da leitura de nucleotídeos do sequenciamento.

construída pelo método de Neighbor Joining revelou que as sequências de DNA não eram idênticas, com uma diferença de no mínimo 19pbe no máximo 49pb, salvo o controle positivo que foi re-sequenciado.

Ou seja, cada exemplar mantido em laboratório como também o VHB oculto apresentavam sequências de DNA diferentes entre si, embora similares a sequências do VHB disponíveis em bancos de dados públicos como o GeneBank.

O valor de bootstrap encontrado em cada nó da árvore filogenética indica o grau de confiança na estrutura da árvore e correspondem aproximadamente ao número de vezes em que aquela forma de organizar as sequências naquele nó da árvore foi observada.

Valores de bootstrap menores que 55% indicam incerteza nos pontos da árvore, e assim há necessidade de uma amostragem mais ampla a fim de obterem-se resultados mais precisos.Dessa forma entende-se que há necessidade de inclusão de um número maior de sequências virais para se construir uma árvore com maior confiabilidade dos resultados.

A detecção de valores de bootstrap altos nos nós das ramificações (>55%) indica que a grande maioria das árvores formadas tem de fato o aspecto encontrado.

Diante do exposto entende-se que a amostra considerada como positiva realmente enquadra um caso de VHB oculto, uma vez que o resultado do sequenciamento exclui a possibilidade de erro humano e de resultado falso-positivo devido à contaminação com os controles utilizados na reação.

5.3 CONSIDERAÇÕES SOBRE O MÉTODO DE EXTRAÇÃO EM POOL DE