5.1.1 Interrupção do gene SUC2
Duas cepas laboratoriais haploides de levedura foram selecionadas para abrigarem os plasmídeos contendo os genes necessários para produção de dTDP-L- ramnose e mono-ramnolipídeos: CEN.PK 102-3A e CEN.PK 113-6B, respectivamente. No entanto, antes de inserir os genes da via de síntese de dTDP- RHA, ambas as cepas tiveram o gene SUC2 interrompido, por meio de recombinação homóloga, com cassete de expressão KanMX contendo gene que confere resistência a geneticina (G418). Dessa maneira, colônias que se mostraram resistentes à geneticina após transformação com KanMX possuem, teoricamente, o gene SUC2 interrompido. Após triagem em meio de cultura sólido contendo G418, colônias positivas foram submetidas a PCR de colônia utilizando os iniciadores de verificação apresentados na Tabela 5. Como esquematizado na Figura 6, o par de iniciadores CH-fwd e CH-rev gera fragmento de aproximadamente 2500 pb em cepas com SUC2 interrompido ou não. Já o par de iniciadores CH-fwd e MidK-ver gera fragmento de 1300 pb apenas em cepa que possui KanMX interrrompendo o gene SUC2. Como pode ser verificado na Figura 7, a amostra 1 (A1) de ambas as cepas mostraram padrão de bandas esperado para interrupção de SUC2, sendo então estocadas e usadas para posteriores transformações.
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Figura 7. Eletroforese da PCR de confirmação da interrupção do gene SUC2 nas cepas CEN.PK 102- 3A (A) e CEN.PK 113-6B (B). M: Marcador 1kb plus ThermoScientific; C-: Água; C+: Cepa parental; An: amostras de cepas após transformação com KanMX e seleção em meio contendo geneticina.
5.1.2 Análise de crescimento em sacarose
A interrupção de SUC2 foi feita para que a sacarose entre intacta na célula e sofra ação da enzima sacarose fosforilase, com o objetivo de direcionar a utilização da glicose contida nesse substrato para a via de produção de dTDP-Rha. Com o objetivo de avaliar o efeito da interrupção desse gene na taxa de crescimento das cepas, a cepa RH1 passou por testes de crescimento em sacarose. Como pode ser visto na Figura 8, RH1 mostrou uma taxa de crescimento específica mais lenta, aproximadamente 85% da taxa de sua cepa parental. Esse comportamento era esperado, visto que o principal gene de metabolização de sacarose foi silenciado. Porém, apesar de não possuir o gene SUC2 funcional, a cepa ainda é capaz de crescer em sacarose. Isso pode ser explicado devido à presença do gene constitutivo MAL2-8c nos genótipos das linhagens RH1 e RL1, que as torna capaz de hidrolisar sacarose, já que esse dissacarídeo pode ser internalizado por transportadores de maltose e ser hidrolisado pela maltase (α-glucosidase) (Mwesigye et al., 1996). No entanto, deve ser enfatizado que a presença de MAL2-8c pode não representar um grande problema de desvio do fluxo metabólico pela enzima maltase, pois a afinidade da sacarose fosforilase (Km 13mM) pela sacarose é bem maior que a da maltase (Km 116-191mM) (Mieyal et al., 1972; Deng et al., 2014). Dessa forma, a sacarose deveria
46 ser, em sua maior parte, convertida pela sacarose fosforilase em glicose-1-fosfato e frutose.
Figura 8. Taxas de crescimento específico máximas (µmáx) da cepa RH1 e sua cepa parental CEN.PK 102-3A. Aplicando o teste T para os valores de taxa de crescimento, obtém-se que o µ de RH1 é menor que o µ de CEN.PK 103-2A com uma confiança maior que 99% (p=0,007).
5.1.3 Atividade de RmlA
Após a análise de crescimento acima, a cepa RH1 foi transformada com o plasmídeo pGAC, resultando na cepa intermediária RH4, ou com o plasmídeo p425GPD vazio, resultando na cepa intermediária de referência RH2 (Tabela 7). Para verificar se os genes estavam sendo expressos antes de continuar com a transformação dos outros plasmídeos, a atividade da enzima RmlA foi testada baseando-se no acúmulo de seu produto dTDP-D-glicose nos extratos das cepas RH2 e RH4 utilizando sacarose como substrato. Por possuir os genes da sacarose fosforilase e RmlA, mas não RmlB, espera-se que o extrato da cepa RH4 acumule
47 dTDP-D-glicose, diferentemente da cepa referência RH2 que não possui nenhum dos genes supracitados. Como esperado, a Figura 9 mostra que RH4 apresenta atividade enzimática para RmlA quase três vezes maior que RH2, indicando que os genes contidos nos plasmídeos epissomais estão sendo funcionalmente expressos.
Figura 9. Atividades enzimáticas de RmlA para as cepas intermediárias RH2 e RH4 utilizando sacarose como substrato. Aplicando o teste T para os valores de atividade enzimática,obtém-se que a atividade em RH4 é maior que a atividade em RH2 com uma confiança maior que 99% (p=0,005).
Em contrapartida, quando o mesmo experimento é realizado utilizando-se glicose-1-fosfato como substrato, as cepas não mostram diferença significativa de atividade de RmlA como pode ser visto na Figura 10.
Esse resultado pode ser explicado pelo fato de que, quando sacarose é utilizada como substrato, além de fornecer glicose-1-fosfato, ela também fornece frutose, que pode ser utilizada na glicólise. Quando glicose-1-fosfato é usada como substrato, é a única fonte de carbono disponível na reação, então a glicólise compete
48 com RmlA pelo substrato. O redirecionamento de glicose-1-fosfato para a glicólise é feito por isoenzimas fosfoglicomutases (PGMs) (Figura 4), nativas em S. cerevisiae. Essas enzimas são responsáveis pela interconversão de glicose-1-fosfato em glicose- 6-fosfato. A PGM2, isoenzima mais relevante responsável por 80-90% da atividade de PGM em levedura, possui alta afinidade por glicose-1-fosfato, reportada em 23,4 μM (Daugherty et al., 1975). Ainda não foi medida a afinidade da RmlA de P. aeruginosa pelo mesmo substrato, mas é razoável concluir que boa parte da glicose-1-fosfato está sendo consumida pelas PGMs para alimentar a via glicolítica. Assim, a atividade de RmlA em RH4 usando esse substrato é virtualmente indetectável.
Figura 10. Atividades enzimáticas de RmlA para as cepas intermediárias RH2 e RH4 utilizando glicose- 1-fosfato como substrato. Aplicando o teste T para os valores de atividade enzimática,obtém-se que a atividade em RH4 é igual à atividade em RH2 (p=0,3).
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5.1.4 Cepas finais
Após a detecção da atividade enzimática de RmlA e inferência de que as outras enzimas também estão sendo expressas, seguiram-se as transformações das cepas intermediárias com os plasmídeos restantes, resultando nas cepas finais produtoras de dTDP-Rha (RHP) e mono-RLs (RLP), assim como suas cepas referências contendo os plasmídeos vazios (RHR e RLR, respectivamente) (Tabela 7). Como esperado, além de serem capazes de crescer na presença de geneticina devido a KanMX, as cepas finais são capazes de crescer em meio mínimo com sacarose sem complementação nutricional, indicando que os plasmídeos estão presentes complementando a auxotrofia das cepas.