Construção de dispositivos microfluídicos em papel

Os métodos utilizados para a construção dos dispositivos microfluídicos baseados em papel e para sua modificação foram desenvolvidos durante estágio na Universidade da Califórnia San Diego (UCSD - USA), sob supervisão do Prof. Dr. Joseph Wang.

Corte das membranas

Cada dispositivo microfluídico é composto por três partes, cortadas separadamente (Figura 1.7). A primeira e a principal parte (i), composta pela membrana de liberação (Standard 14 Conjugate release pad, GE Healthcare - EUA),

compreende as áreas de amostra (S) e de conjugado (C) do sensor. Esta parte tem cerca de 2 cm de largura e foi cortada por um laser CO2 da marca Orion Motor com um tubo de 40 W e velocidade de digitalização de 0-400 mm/s. A segunda parte (ii), que corresponde à zona de teste, é composta por NC (FF120HP PLUS, GE Healthcare, EUA) e tem um formato circular, com 3 mm de diâmetro. Um cortador de pressão manual foi usado para fabricá-la com precisão (3EG, EDA - Brasil), garantindo reprodutibilidade entre as peças. A terceira e última parte (iii) corresponde à zona absorvente, composta por uma membrana de celulose espessa (CFSP173000, Merck Millipore - EUA). A reprodutibilidade no corte dessas estruturas não é tão importante quanto para as outras peças, pois sua função - que é absorver todo o excesso de amostra e reagentes - é minimamente afetado por sua forma. A principal característica a ser mantida é a largura na parte superior da peça, que determinará a velocidade de fluxo da amostra para a zona absorvente. Como essa distância pode ser facilmente controlada sem o uso de técnicas específicas, essas estruturas foram cortadas com o uso de uma tesoura.

Modificação das plataformas de papel

Três áreas diferentes do dispositivo devem ser modificadas para assegurar seu funcionamento adequado: 1) A área de teste, que deve possuir Ab ou proteínas específicos imobilizados à sua superfície, dependendo do formato do teste a ser utilizado; 2) a área de conjugados, que deve conter complexos AuNP-Ab que sejam capazes de se mover com o fluxo de amostra e 3) a zona da amostra, que deve ser modificada com Tween-20 para assegurar um fluxo de líquido uniforme. Além disso, os braços do dispostivo tem função específica sendo, um deles, para detecção de Clusterina, o segundo para detecção de Fetuína B e o terceiro um controle de fluxo de amostra.

A área de teste, composta por membranas de NC, foi modificada pela adição de 1 µL de solução de Ab específico (1 mg/mL, PBS 1x) por 15 min, no caso do ensaio sanduíche aplicado para a Fetuína B, ou pela modificação com 3 µL de proteína (0,25 mg/mL, PBS 1x) por 45 min, no caso do ensaio competitivo utilizado para Clusterina. Em seguida, a membrana foi lavada 3x usando PBS, para remover qualquer excesso

da biomolécula, e seca usando ar comprimido. Após, 10 µL de uma solução de BSA 1% (Albumina de soro bovino) (PBS 1x, Sigma Aldrich - EUA) foram incubados por 5 min a fim de bloquear quaisquer sítios de interação disponíveis na membrana. A NC foi então lavada com PBS 3x para remover o excesso de reagente. Por fim, a membrana foi seca com ar comprimido e armazenada na geladeira para uso posterior. Anticorpos policlonais anti-Fetuína B (11834-RP01) e anti-Clusterina (11297-RP01) foram adquiridos da empresa Sino Biological (China), assim como seus respectivos antígenos - Fetuína B (11834-H08H) e Clusterina (11297-H08H). Soluções estoque de proteína foram quantificadas utilizando o equipamento Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Brasil).

Figura 1.7 - Peças cortadas para a montagem do dispositivo microfluídico e sua estrutura final. i) Peça principal, composta pela membrana de liberação. Engloba as zonas de amostra (S) e de conjugado (C). ii) zona de teste (T), composta por NC; iii) Zona absorvente (A), composta por membrana de celulose. iv) Dispositivo montado.

Fonte: Elaborada pela autora.

A zona de conjugados, por sua vez, deve ser carregada com AuNP-Ab específicos para os analitos. Os conjugados foram fabricados utilizando o kit InnovaCoat® Gold 20 nm, seguindo precisamente as instruções do fabricante (Expedeon – Inglaterra). Para o carregamento da zona conjugada, foram adicionados 2,5 µL de AuNP-Ab e aguardou-se 30 min para secagem, em temperatura ambiente (24 o_{C). O processo foi repetido 3 vezes, totalizando a adição de 10 µL de conjugado} em cada zona. Depois que o dispositivo estava completamente seco, foi armazenado em geladeira (4 o_{C) para uso posterior.}

A terceira e última modificação foi realizada na zona de amostra. Para assegurar um fluxo de líquido uniforme através do dispositivo, uma gota de 10 µL de

uma solução 0,1% de Tween-20 (água ultrapura, Sigma Aldrich - EUA) foi adicionada à área que receberá a amostra e seca ao ar, em temperatura ambiente (24 o_C).

Montagem e uso do dispositivo

Uma plataforma de PET (Polietileno tereftalato) foi utilizada como suporte para montagem do dispositivo (Figura 1.8). Inicialmente, uma área de PET de 3,0 x 3,0 cm foi coberta com fita dupla face. Em seguida, três membranas de NC não modificadas foram coladas, utilizando um molde (A). As membranas de NC foram modificadas na plataforma PET (B) e, em seguida, a parte principal (com as zonas conjugadas já carregadas com AuNP-Ab e a zona de amostra modificada com Tween-20) (C) e a zona absorvente (D) foram adicionadas para formar o dispositivo final. As estruturas foram coladas com uma pequena sobreposição (~ 0,5 mm), garantindo um fluxo uniforme de amostra entre cada peça. Finalmente, o excesso de PET é cortado. Para a realização da análise, 50 µL de amostra foram adicionados ao centro do dispositivo. Para os testes padrão, as proteínas foram preparadas em Tris-HCl (50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM).

Figura 1.8 - Procedimento de montagem do dispositivo. A) membranas NC não modificadas são posicionadas no PET usando fita dupla face; B) as membranas NC são modificadas com Ab específico; C) a peça principal, já carregada com o AuNP-Ab, é colocada em posição; D) a zona absorvente é adicionada para formar o dispositivo final.

Fonte: Elaborada pela autora.

Um estojo 3D portátil foi projetado para encaixar nas plataformas de papel, mantendo apenas as zonas de amostra e de teste visíveis. Este foi construído utilizando a impressora 3D Prusa i3 MK2. O estojo é composto por 2 partes: uma superior, que possui aberturas para as zonas de teste e amostra e ranhuras para

encaixar a peça principal do sensor; e uma inferior, que corresponde à uma tampa para fechar o dispositivo. A peça superior pode ser vista em detalhes na Figura 1.9. O estojo deve facilitar o uso dos dispositivos para pessoal não especializado, que só será capaz de visualizar as áreas necessárias.

Figura 1.9 - Parte superior do case impresso em 3D projetado para encaixar no dispositivo desenvolvido. A) vista superior. Os 3 orifícios externos mantêm as zonas de teste visíveis e acessíveis, enquanto o orifício central corresponde à zona de amostra; B) Vista interna do case, mostrando as ranhuras para encaixe do dispositivo; C) Parte principal do dispositivo encaixada na parte interna do case.

Fonte: Elaborada pela autora.