Construções dos plasmídeos

a) Construção gênica para obter a superexpressão de Bzo2h2

A obtenção do cDNA Bzo2h2 inteiro (n° de ac. AF310223) foi realizada a partir da extremidade 5’ de 110 pb obtida a partir de 5’ RACE clonada em pGEM-T easy (clone 5’) (Promega, EUA) e da extremidade 3’ de 730 pb proveniente do screening do banco de cDNA de semente em desenvolvimento de A. thaliana clonada em pBKS+ _{(clone 3’). O} clone 5’ foi amplificado com os oligonucleotídeos RIL3 e LG1 (Tabela I) e o clone 3’ com os oligonucleotídeos LG2 e LG3 (Tabela I). O produto da PCR do clone 5’ digerido com

Hind III e Xba I e o produto da PCR do clone 3’ digerido com Xba I e EcoR I foram

purificados, ligados pelas extremidades Xba I e clonados nos sítios Hind III e EcoR I em pUC 18 (Stratagene) para formar o clone Bzo2h2::pUC18 (Figura 4) e então seqüenciados. O cDNA inteiro foi purificado como um fragmento Hind III – EcoR I e tratado com DNA polymerase I large (Klenow) fragment (Invitrogen) conforme recomendação do fabricante, a fim de obtermos extremidades cegas. Para a construção de Bzo2h2::pRT-Ω (Figura 4), o fragmento de 840 pb com extremidades cegas foi clonado em pRT- Ω (Überlacker e Werr, 1996) previamente digerido com BamH I, tratado com

DNA polymerase I large (Klenow) fragment e desfosforilado pelo tratamento com fosfatase

alcalina (Amersham Pharmacia Biotech), conforme recomendação do fabricante. A identificação dos clones positivos e a verificação da orientação do inserto foram realizadas pelas digestões com Pst I e Pst I - Xba I, respectivamente. O cassete 35S::Bzo2h2 foi clonado no sítio Pst I do vetor de transformação pCAMBIA 3300 (www.cambia.org.br) e a orientação verificada pela digestão com Xho I e Xba I.

b) Construção gênica para obter o silenciamento gênico de Bzo2h2

Segundo Chuang e Meyerowitz (2000), a formação de uma dupla fita de RNA desencadeia o silenciamento gênico do gene alvo de uma maneira muito mais eficiente do que simplesmente a formação de uma fita simples de RNA na orientação antisenso. Essa dupla fita é formada pela transcrição de um cassete que contenha um fragmento do gene de interesse na orientação senso e antisenso intercalados por uma seqüência nucleotídica qualquer. Para isso, foi construído um cassete de expressão onde um fragmento do cDNA Bzo2h2 (436-847 pb, n° de ac. AF310223) na orientação antisenso e senso são separados por uma seqüência do gene gusA (786-1809pb, n° de ac. M14641)

Construção do cDNA inteiro 5’ Hind III Xba I

clone 5‘

Hind III Xba I EcoR I Bzo2h2 cDNA inteiro

EcoR I Xba I Extremidade 3’ clone 3’ Digestão dos produtos de PCR Bzo2h2::pUC18 35 S Xba I Pst I poly A

Ω Bzo2h2 cDNA inteiro

Pst I Clonagem do cDNA Bzo2h2 inteiro em pRT-Ω 35S::Bzo2h2 Clonagem do cassete de expressão 35S::Bzo2h2 no vetor pCAMBIA 3300 Xho I LacZ polyA bar 35S EcoR I Hind III pUC 18 MCS pCAMBIA 3300

Borda esquerda Borda direita

Figura 4: Estratégia para construção do cassete de expressão 35S::Bzo2h2 e sua clonagem no vetor de transformação de plantas pCAMBIA 3300. 35S: promotor 35 S do vírus do mosaico da couve-flor; Ω: seqüência 5’ não traduzida de vírus do mosaico do tabaco; poly A: sinal de poliadenilação do vírus do mosaico da couve-flor; bar: gene bar, confere resistência à fosfinotricina, LacZ: gene da β-galactosidase; pUC 18 MCS: multiple cloning site (Hind III, Sph I, Pst I, Sal I, Acc I, Hinc II, Xba I, BamH I, Xma I, Kpn I, Sst I, EcoR I).

sob o controle do promotor 35 S do CaMV (Figura 5). Os fragmentos antisenso e senso de 411 pb do cDNA Bzo2h2 com os sítios de restrição Xho I e BamH I, Sst I e Xba I, respectivamente foram obtidos por amplificação a partir do cDNA Bzo2h2 com o oligonucleotídeos LG5 e LG6 (Tabela I). A seqüência de 1023 pb do gene gusA, utilizada como intercaladora entre os fragmentos de cDNA antisenso e senso, foi amplificada a partir do vetor pBI 121 (Clontech, EUA) com os oligonucleotídeos LG9 e LG10 que adicionam os sítios BamH I e Sst I, respectivamente. Cada um dos produtos de PCR foi clonado em pUC18 e seqüenciados. Inicialmente, o cDNA parcial antisenso digerido com

Xho I e BamH I e o fragmento do gene gusA digerido com BamH I e Sst I foram clonados

nos sítios Xho I e Sst I do vetor pRT100 (Überlacker e Werr, 1996). Posteriormente, o cDNA parcial senso digerido com Sst I e Xba I foi clonado no plasmídio H2antiseno::gusA- pRT100. O cassete completo Bzo2h2 dsRNA, contendo os cDNA senso e antisenso separados por um fragmento do gene gusA, sob o controle do promotor 35S e com um sinal de poliadenilação (35S::H2antisenso::gusA::H2senso::polyA), foi liberado pela digestão com Pst I e clonado em pCAMBIA 2300 (www.cambia.org.br). A orientação do cassete foi verificada pela digestão com as enzimas de restrição BamH I e Xho I.

c) Fusão traducional da seqüência promotora Bzo2h2 ao gene marcador gusA

A seqüência promotora do gene Bzo2h2 foi definida a partir da identificação da seqüência nucleotídica presente nos bancos de dados. Inicialmente, com o projeto genoma ainda não concluído, a seqüência disponível foi de cerca de 500 pb upstream ao gene. A qual foi utilizada para construir a fusão traducional com o gene marcador gusA (Figura 6). Entretanto, com o término do projeto genoma, foi possível verificar a presença de mais 1500 pb upstream ao gene Bzo2h2, sendo então utilizado cerca de 1,8 kb para realizar uma nova fusão traducional da seqüência promotora Bzo2h2 com o gene marcador gusA (Figura 6).

A seqüência promotora de cerca de 500 pb foi amplificada com o par de oligonucleotídeos, S3GUS5 e S3GUS3 (Tabela I), digerida com BamH I (o sítio presente na extremidade 3’ foi adicionado pelo oligonucleotídeo S3GUS3 e o da extremidade 5’ estava presente na seqüência), gerando um fragmento de 524 pb que foi clonado em pUC 18 para seqüênciamento. A seqüência promotora de 1800 pb foi amplificada com os oligonucleotídeos S3GUS3 e LG4 que adicionam os sítios BamH I e Pst I

EcoR I Pst I Hind III Xho I pUC 18 MCS LacZ polyA npt II 35S Pst I Pst I 35S::H2antisenso::gusA::H2senso::polyA H2antisenso::gusA-pRT100 Clonagem do fragmento Bzo2h2 cDNA senso nos sítios Sst I e Xba I de H2antisenso::gusA-pRT100 polyA 35 S cDNA parcial Xho I gusA BamH I Sst I Xba I (Bzo2h2 dsRNA)

Clonagem do cassete de expressão

Bzo2h2 dsRNA no vetor pCAMBIA 2300

Pst I gusA BamH I Sst I Xho I cDNA parcial BamH I _{Sst I Xba I} cDNA parcial cDNA parcial gusA polyA cDNA parcial BamH I Sst I Xba I Xho I 35 S Produtos da PCR digeridos com as enzimas indicadas para a clonagem em pRT100

Clonagem dos fragmentos Bzo2h2 cDNA antisenso e gusA em pRT100

Borda esquerda _{pCAMBIA 2300} Borda direita

Figura 5: Estratégia para construção do cassete de expressão Bzo2h2 dsRNA e sua clonagem no vetor de transformação de plantas pCAMBIA 2300. 35S: promotor 35 S do vírus do mosaico da couve-flor; poly A: sinal de poliadenilação do vírus do mosaico da couve-flor; npt II: gene da neomicina fosfotransferase II, confere resistência à canamicina, LacZ: gene da β-galactosidase; pUC 18 MCS: multiple cloning site (Hind III, Sph I, Pst I, Sal I, Acc I, Hinc II, Xba I, BamH I, Xma I, Kpn I, Sst I, EcoR I). As setas indicam a orientação do cDNA.

EcoR I Hind III BamH I

H2 pro 2,0 Kb

Digestão do vetor pBI 121 com Xba I e EcoR I para liberar o cassete com o gene gusA e clonagem em pUC 18

pBI 121

EcoR I

35S

Xba I BamH I

gusA Nos ter

BamH I BamH I

H2 pro 0,5 Kb

gusA::pUC 18

gusA Nos ter

Pst I Xba I BamH I _{EcoR I}

Ligação dos cassetes com o promotor 1,8 Kb e 0,5 Kb nos sítios EcoR I e Pst I - EcoR I, respectivamente, do vetor pCAMBIA 2300 EcoR I + 42 pb -1,8 kb _{H2pro(1,8Kb)::gusA-pUC18} EcoR I BamH I Pst I BamH I H2 pro 1,8 Kb

Hind III BamH I Pst I

gusA

EcoR I Nos ter

gusA Nos ter

H2 pro 0,5 Kb H2pro(0,5Kb)::gusA-pUC18 + 66 pb - 481 pb Produtos da PCR digeridos Pst I

Ligação dos produtos de PCR em fase com gusA::pUC 18 Hind IIII EcoR I pUC 18 MCS Xho I Xho

I

Borda direita pCAMBIA 2300 Borda esquerda

Figura 6: Estratégia para obtenção da fusão traducional da seqüência promotora Bzo2h2 com o gene gusA e sua clonagem no vetor de transformação de plantas pCAMBIA 2300 ou pCAMBIA 3300. 35S: promotor 35 S do vírus do mosaico da couve-flor; pro: seqüência promotora; Nos ter: terminador da nopalina sintetase; poly A: sinal de poliadenilação do vírus do mosaico da couve-flor; npt II gene da neomicina fosfotransferase II, confere resistência à canamicina, LacZ: gene da β-galactosidase; pUC 18 MCS: multiple cloning site (Hind III, Sph I, Pst I, Sal I, Acc I, Hinc II, Xba I, BamH I, Xma I, Kpn I, Sst I, EcoR I).

respectivamente, gerando um produto de 2020 pb que foi clonado em pGEM-T easy (Promega). Ambos produtos de PCR incluem 42 nucleotídeos, ou seja, 14 aminoácidos da seqüência codificante do gene Bzo2h2.

Para a construção do cassete de expressão H2 promotor::gusA, o vetor pBI 121 (Jefferson, 1987) foi digerido com Hind III e EcoR I para promover a liberação do gene

gusA (Figura 7). Este cassete foi subclonado nos sítios Xba I e EcoR I de pUC 18 gerando

o plasmídeo gusA-pUC 18. As duas seqüências promotoras utilizadas, de 524 pb e de 1800 pb, foram clonadas nos sítios BamH I e Pst I-BamH I de gusA:pUC 18, respectivamente, resultando nos plasmídeos H2pro(0,5 Kb)::gusA-pUC18, e

H2pro(1,8Kb)::gusA-pUC18. A orientação da integração dos dois cassetes foi verificada

por digestão com Pst I-EcoR I para o plasmídeo Bzo2h2pro(0,5 Kb)::gusA-pUC 18 e com

Pst I-BamH I e Pst I-Hind III para o plasmídeo Bzo2h2pro(1,8 Kb)::gusA-pUC18. A

manutenção da fase de leitura correta da seqüência Bzo2h2 fusionada ao gene gusA foi verificada por sequenciamento. O cassete Bzo2h2pro(0,5 Kb)::gusA::NOSter foi liberado por digestão com BamH I e EcoR I e clonado no vetor de transformação de plantas pCAMBIA 3300, e o cassete Bzo2h2pro(1,8 Kb)::gusA::NOSter foi liberado por digestão

EcoR I e clonado no vetor de transformação pCAMBIA 2300. A orientação do cassete Bzo2h2pro(1,8 Kb)::gusA::NOSter foi verificada por digestão com Xho I – Hind III.

2.2.2 Transformação genética de A. thaliana e obtenção das linhagens homozigotas para