3.2 M´ etodos de manipula¸c˜ ao de DNA e constru¸c˜ ao de plasm´ıdeos
3.2.4 Constru¸c˜ ao de plasm´ıdeos
Os oligonucleot´ıdeos utilizados para clonagens e sequenciamento de DNA est˜ao descritos
na Tabela 3.3 e os plasm´ıdeos utilizados neste estudo, descritos na Tabela 3.4, foram
constru´ıdos de acordo com as estrat´egias de clonagem descritas abaixo.
No XXXXOligo xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxSequˆencia Referˆencia
01 RRP6XbaI-For 50- CTCGAGCCTTTTAAATGACAGATTCTTACCTTTGG -30 Este estudo
02 RRP6Xho-Rev 50- TCTAGAATGACTTCTGAAAATCCGGATGTAC -30 Este estudo
03 TRF4BgI II-For 50- AGATCTATGGGGGCAAAGAGTGTAACAGC -30 Este estudo
04 TRF4Sal I-Rev 50- GTCGACAAGGGTATAAGGATTATATCCA -30 Este estudo
05 TRF4FOR700 50- TGTATTCGTTAGCAAGCCAT -30 Este estudo
06 TAPCHindIII -Rev 50- AGCTTTCATGCCTCAGGTGACTTCCCCGCGGAATTC -30 Este estudo
07 TAPCXhoI-For 50- CTCGAGATGGAAAAGAGAAGATGGAAAAAG -30 Este estudo
08 NOP53BamHI-For 50- GGATCCATGGCTCCAACTAATCTAAC -30 Este estudo
09 NOP53SalI-Rev 50- GTCGACCTATTTGAAGTCCTTATGTGTCCAC -30 Este estudo
10 GST-For 50- GGTGATCATGTAACCC -30 Goldfeder, 2008
11 Sp6 50-TATTTAGGTGACACTATAG-30 Promega
12 T7 50-TAATACGACTCACTATAGGG-30 Promega
S´ıtios de restri¸c˜ao est˜ao destacados em negrito.
Tabela 3.3: Oligonucleot´ıdeos utilizados para clonagens e seq¨uenciamento de DNA.
Os oligonucleot´ıdeos utilizados para clonagens e sequenciamento de DNA est˜ao descritos na Tabela os plasm´ıdeos utilizados neste estudo, descritos na Tabela foram constru´ıdos de acordo com as estrat´egias de clonagem descritas abaixo.
Os oligonucleot´ıdeos utilizados para clonagens e sequenciamento de DNA est˜ao descritos na Tabela os plasm´ıdeos utilizados neste estudo, descritos na Tabela foram constru´ıdos de acordo com as estrat´egias de clonagem descritas abaixo. om as estrat´egias de clonagem descritas abaixo.
Os oligonucleot´ıdeos utilizados para clonagens e se ados para clonagens e sequenciamento de DNA est˜ao descritos na Tabela os plasm´ıdeos utilizados neste estudo, descritos na Tabela foram constru´ıdos de acordo com as estrat´egias de clonagem descritas abaixo. om as estrat´egias de clonagem descritas abaixo.
Os oligonucleot´ıdeos utilizados para clonagens e se agem descritas abaixo. om as estrat´egias de clonagem descritas abaixo.
44 3.2. M´etodos de manipula¸c˜ao de DNA e constru¸c˜ao de plasm´ıdeos
Plasm´ıdeo Caracter´ısticas Referˆencia
pMET MET 251, URA3, CEN 6 Perona, n˜ao
publicado
pMET-RRP 43-TAP MET 25::RRP 43, URA3, CEN 6 Oliveira et al.
2002 pMET-rrp43-2-TAP
[Cys230Tyr, Ile274Thr, Cys276Tyr]
MET25:: rrp43-2, URA3, CEN 6 Oliveira et al. 2002
pMET-rrp43-3-TAP [Asn78Asp, Val133Met, Ser162Phe, Ala246Thr]
MET 25:: rrp43-3, URA3, CEN 6 Oliveira et al. 2002
pGEM-T lacZ, AmpR Promega
pGEM-T-RRP6 lacZ, AmpR Este estudo
pGEM-T-TRF44 lacZ, AmpR Este estudo
pGEM-T-TAP lacZ, AmpR Este estudo
pMET-CWC24-TAP MET 25::CWC 24 URA3, CEN 6 Perona,n˜ao
publicado
pMET-RRP6-TAP MET 25::RRP 6, URA3, CEN 6 Este estudo
pMET-TRF4-TAP MET 25::TRF 4, URA3, CEN 6 Este estudo
pUG34-RRP42 MET 25::yEGFP 33- Rrp42, HIS 3, CEN 6
Gonzales & Oliveira, n˜ao publicado
pUG34-RRP44 MET 25::yEGFP 3- RRP 44, HIS 3, CEN 6
Gonzales & Oliveira, n˜ao publicado
pUG34-RRP45 MET 25::yEGFP 3- RRP 45, HIS 3, CEN 6
Gonzales & Oliveira, n˜ao publicado
pUG34-RRP6 MET 25::yEGFP 3- RRP 42, HIS 3, CEN 6
Gonzales & Oliveira, n˜ao publicado
pGEM-T easy-NOP53 lacZ, AmpR Este estudo
∗A muta¸c˜oes no gene da RRP 43 est˜ao destacados em negrito.
∗N´umeros entre colchetes representam os res´ıduos de amino´acidos codificados nos plasm´ıdeos.
1 MET 25, promotor do gene MET 25 (O-acetil homoserine-O-acetil serina sulfidrilase) de Saccharomyces cerevisiae. 2 GST, glutationa-S-transferase de S japonicum.
Continua¸c˜ao....
Plasm´ıdeo Caracter´ısticas Referˆencia
pGEX GST2 , lacI, AmpR GE Healthcare
pGEX-NOP53 GST::NOP53, lacI, AmpR Este estudo
pET-His-RRP40 HIS 6::RRP 40, lacI, AmpR Luz, 2006
pET-His-RRP43 HIS 6::RRP 43, lacI, AmpR Luz, 2006
pET-His-RRP45 HIS 6::RRP 45, lacI, AmpR Luz, 2006
pUG34-rrp6FL[1 − 619] MET 25::rrp6FL-yEGFP 33, HIS 3, CEN 6
Gonzales & Oliveira, n˜ao publicado
pUG34-rrp6∆C[1 − 398] MET 25::rrp6∆C-yEGFP 3, HIS 3, CEN 6
Gonzales & Oliveira, n˜ao publicado
pUG34-rrp6N[1 − 106] MET 25::rrp6N-yEGFP 3, HIS 3, CEN 6
Gonzales & Oliveira, n˜ao publicado
pUG34-rrp6C[532 − 619] MET 25::rrp6C-yEGFP 3, HIS 3, CEN 6
Gonzales & Oliveira, n˜ao publicado
pUG36 MET 25::yEGFP 3, URA3, CEN 6 Goldfeder,2008
pUG36-rrp6FL[1 − 619] MET 25::rrp6FL-yEGFP 3, URA3, CEN 6 Este estudo
pUG36-rrp6∆C[1 − 398] MET 25::rrp6∆C-yEGFP 3, URA3, CEN 6 Este estudo
pUG36-rrp6N[1 − 106] MET 25::rrp6N-yEGF P3, URA3, CEN 6 Este estudo
pUG36-rrp6C[532 − 619] MET 25::rrp6C-yEGFP 3, URA3, CEN 6 Este estudo
∗A muta¸c˜oes no gene da RRP 43 est˜ao destacados em negrito.
∗N´umeros entre colchetes representam os res´ıduos de amino´acidos codificados nos plasm´ıdeos.
1 MET 25, promotor do gene MET 25 (O-acetil homoserine-O-acetil serina sulfidrilase) de Saccharomyces cerevisiae. 2 GST, glutationa-S-transferase de S japonicum.
3 GFP, green fluorescent protein de A. victoria.
Tabela 3.4: Plasm´ıdeos utilizados neste estudo.
Para ensaios de crescimento, express˜ao e purifica¸c˜ao do exossomo e complexo
TRAMP na cepa mutante condicional ∆nop53 de Saccharomyces cerevisiae pelos m´etodos
de cromatografia de afinidade TAP-tag (Tandem affinity purification) e gradiente de
glicerol. Os DNAs correspondentes `as ORF (open reading frame) YOR001W / RRP6 e
46 3.2. M´etodos de manipula¸c˜ao de DNA e constru¸c˜ao de plasm´ıdeos
Saccharomyces cerevisiae e os primers correspondentes para cada gene descritos na Tabela
3.3, com s´ıtios de reconhecimento para as enzimas de restri¸c˜ao: RRP 6: XbaI-XhoI e.
T rf 4: BglII e SalI. Simultaneamente, foi amplificado o TAP utilizando DNA plasmidial
pBS 1479 e os primers 06 e 07, com s´ıtios de restri¸c˜ao HindIII e XhoI. Separadamente,
os genes foram clonados no vetor pGEM-T (promega), gerando os plasm´ıdeos: pGEM-
T-RRP6, pGEM-T-TAP e pGEM-T-TRF4 que foram sequenciados. Estes vetores
foram clivados com as enzimas de restri¸c˜ao adequadas para cada gene e os fragmentos
purificados de gel de agarose foram subclonados no vetor pMET25-CWC24-TAP (Perona,
2013), usando a seguintes estrat´egias:
Vetor linearizado por clivagem com XbaI e XhoI foi ligado com dois fragmentos RRP6 e TAP, gerando o plasm´ıdeo pMET-RRP6-TAP.
Vetor linearizado por clivagem com BamHI e SalI foi ligado com dois fragmentos: TRF4 e TAP, gerando o plasm´ıdeo pMET-TRF4-TAP.
Para estes mesmos ensaios, foram usados os plasm´ıdeos: pMET-RRP43-TAP, pMET-
rrp43-2 -TAP e pMET- rrp43-3 -TAP, obtidos anteriormente no laborat´orio (Oliveira
et al., 2002) que expressam Rrp43 (selvagem ou mutante) em fus˜ao com as prote´ınas
CBP (camodulim binding protein) e Prote´ına A de Staphylococcus aureus na extremidade
carboxi-terminal.
Para os ensaios de co-imunoprecipita¸c˜ao de mutantes de Rrp6 com Rrp43-TAP e
Nop53-TAP na cepa mutante ∆nop53 de Saccharomyces cerevisiae, foram utilizadas as
constru¸c˜oes realizadas por Gonzales & Oliveira (n˜ao publicado) , descritos na Tabela
3.3. Essas constru¸c˜oes expressam por¸c˜oes truncadas da Rrp6 fusionadas `a N-terminal da
prote´ına verde fluorescente (GFP Green Fluorescent protein): rrp6N (res´ıduos 1 − 106), rrp6∆C (res´ıduos 1 − 398), rrp 6C (res´ıduos 532 − 619) e Rrp6FL (full-length res´ıduos 1 − 619). Os mutantes de Rrp6 foram excisados de clones nos plasm´ıdeos pUG34 atrav´es
de clivagem com EcorI e SalI, com o objetivo de trocar a marca de sele¸c˜ao de auxotrofia
subclonados no vetor pUG36, originado os plasm´ıdeos: pUG36-r
Rrp6FL[1-619], pUG36-rrp6∆C[1-398], pUG36-rrp6N[1-106], pUG36-rrp6C [532-619].
Para a express˜ao de prote´ınas recombinantes em bact´erias para o ensaio de pull down,
o gene de NOP 53 (YPL146C) foi amplificado com o DNA genˆomico e os primers 08 e 09
(tabela 3.3), O produto foi clonado no vetor pGEM-T easy, gerando o plasm´ıdeo pGEM –T
easy-NOP53, Ap´os de sequenciamento, foi digerido nos s´ıtios de restri¸c˜ao com enzimas
BamHI e SalI. O fragmento purificado foi subclonados no vetor pGEX previamente
linearizado como BamHI e SalI, gerando o plasm´ıdeo pGEX-NOP53 que permite
a express˜ao da prote´ına de fus˜ao GST-Nop53 em E.coli. Para mesmo ensaios foram
utilizados, os genes RRP40 (ORF YOL142W), RRP43 (ORF YCR035C) e RRP45 (ORF
YDR280W) j´a estavam dispon´ıveis no laborat´orio na fus˜ao pET-His-RRP40, pET-His-
RRP43, pET-His-RRP45 (Luz, 2006), utilizados para express˜ao da prote´ına recombinante
como His6.