Contagem das células em câmara de Neubauer

Os protozoários foram diluídos em diluições seriadas de 100 vezes em PBS 1x contendo formaldeído a 4 %. Dez µL da diluição foram usados para preencher ambos os compartimentos da câmara de Neubauer. Todos os protozoários do quadrante central foram contados. Cada contagem foi feita em duplicata, e o valor

final (células/mL) foi determinado efetuando-se a média das contagens, multiplicando-a pelo fator de diluição e pela ordem de grandeza da câmara (1,0 x 10⁴).

5.8.2. Transfecção em A. deanei

Em torno de 1 x 10⁸ protozoários na densidade de 0,4 x 10⁸ a 0,8 x 10⁸ células/mL foram coletados e centrifugados por 10 min a 3000 rpm (Eppendorf Centrifuge 5804R). O meio foi descartado e as células foram lavadas uma vez com PBS 1x gelado e uma vez com tampão de eletroporação gelado. Os protozoários foram ressuspensos em volume que garantisse 0,5 x 10⁸ células/mL. De 80 a 100 µg de DNA circular ou linearizado (para integração no genoma) foram utilizados em 400 µL de células (equivalente a 0,2 x 10⁸ células), transfectadas por eletroporação (Bio-RAD Gene Pulser Xcell) nas seguintes condições: 2 pulsos com intervalo de 10 segundos, a 450 V e 500 µF em cubetas de 0,2 cm de espessura. O controle negativo (mock) foi eletroporado nas mesmas condições, porém sem DNA. As células foram imediatamente inoculadas em 5 mL de LIT incompleto e recuperados a 28 °C por 4 horas.

5.8.3. Seleção dos protozoários transfectados

Seis horas após a recuperação, os protozoários foram inoculados em meio M199 acrescido de 10 % de LIT completo, na densidade de 0,2 x 10⁷ e contendo antibiótico de seleção (G418 ou higromicina). As células foram acompanhadas pela visualização em microscópio de luz invertido. Quando as culturas atingiram cerca de 10⁷ protozoários/mL, elas foram diluídas a 10⁴ células/mL em novo meio de cultura.

O período de seleção foi finalizado quando não foi mais possível observar células vivas no mock.

5.8.4. Eletroporação de A. deanei com FITC-dextrana 150 kDa

Este experimento foi adaptado do estudo de Graziadei, Burfeind e Bar-Sagi (1991). O composto fluorescente FITC conjugado a dextrana 150 kDa (TdB Consultancy, Uppsala, Suécia), gentilmente cedido pelo Dr. Erik Svensjö (UFRJ), foi

preparado em água ultrapura na concentração estoque de 20 mg/mL. Em torno de 0,2 x 10⁸ células de A. deanei ou de T. cruzi cepa G foram usadas em cada eletroporação, como descrito no item 5.8.2. O modelo de cubetas usadas e os parâmetros de eletroporação foram os mesmos descritos no 5.8.2. Cada cultura de tripanossomatídeo foi submetida a três condições distintas: (i) + FITC/+

eletroporação = 400 µL da suspensão de células misturadas a 840 µg de FITC-dextrana 150 kDa e eletroporados em seguida; (ii) –FITC/+ eletroporação = 400 µL da suspensão foram eletroporadas sem o composto fluorescente e (iii) + FITC/–

eletroporação = 400 µL da suspensão foram incubadas com 840 µg de FITC-dextrana 150 kDa em gelo por 10 min., sem receber o pulso elétrico. Após estes tratamentos, as células foram lavadas uma vez com PBS 1x para remover o composto fluorescente não incorporado. Após centrifugação por 5 min. a 3.000 rpm (Eppendorf Centrifuge 5415C), a células foram ressuspensas em 1 mL de PBS 1x. A fluorescência celular foi avaliada por microscopia e por FACS.

5.8.5. Análise por microscopia de fluorescência

Após a seleção das células de A. deanei contendo GFP ou aquelas submetidas ao experimento com FITC-dextrana 150 kDa, uma alíquota de 4 µL de cada amostra (≈10⁵ protozoários) foi usada no preparo de lâmina microscópica.

Após selar a lamínula com esmalte, cada amostra preparada a fresco foi visualizada em aumento de 400 a 1000 x sob filtro para FITC (excitação em 465 a 495 e emissão em 515 a 555 nm), em microscópio Nikon Eclipse E400 Epi-Fluorescence.

Alternativamente, as células contendo GFP foram fixadas e coradas com DAPI. Em torno de 10⁶ células lavadas em PBS 1x foram fixadas em 500 µL de metanol absoluto por 5 min., lavadas mais uma vez com PBS 1x e ressuspensas neste tampão. As células foram aderidas por 15 min em lâminas previamente cobertas com poli-lisina e então lavadas com PBS 1x para retirar as células não aderidas. Em seguida, 20 µL de Triton X-100 0,05% foram adicionados sobre elas, reagindo por 1 min. 30 seg. As células foram lavadas mais uma vez com PBS 1x e coradas com 20 µL DAPI por 5 min. Essa e as seguintes etapas foram realizadas ao abrigo da luz. Após este período, as células foram lavadas duas vezes com PBS 1x e secadas a 37 °C. Para reduzir a perda de fluorescência de DAPI, 2 µL de

N-propil-galacto 2,5 % foram adicionados sobre as células. As lâminas tiveram as lamínulas seladas com esmalte e foram submetidas à microscopia de fluorescência sob os filtros de DAPI (excitação em 325 a 375 nm e emissão em 435 a 485 nm) e FITC.

5.8.6. Análise de fluorescência por FACS

Em torno de 2 x 10⁶ protozoários foram lavados duas vezes com PBS 1x e ressuspensos em 1 mL deste mesmo tampão. As células foram analisadas pelo citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson). As células selvagens epimastigotas de T. cruzi e coanomastigotas de A. deanei foram usadas para estabelecer valores de corte para os parâmetros analisados. A fluorescência foi determinada em filtro FL1 (emissão de 515 a 545 nm), no total de 100.000 eventos.

Os dados gerados pela citometria de fluxo foram analisados pelo programa Cyflogic versão 1.2.1 (<http://www.cyflogic.com/index.php?link1=1&link2=4>).

5.8.7. Extração de proteínas e análise por eletroforese em gel SDS-PAGE

Cerca de 1 x 10⁸ protozoários na densidade de 0,4 x 10⁸ a 0,8 x 10⁸ células/mL foram coletados e centrifugados a 5.000 rpm por 5 min a 4°C (Eppendorf Centrifuge 5804R). O meio de cultivo foi descartado e o sedimento foi lavado duas vezes em PBS 1x gelado. As células foram ressuspensas em 200 µL de tampão de amostra para SDS-PAGE e fervidas por 10 min. Vinte microlitros das amostras (equivalente a 0,1 x 10⁸ protozoários) foram separados em géis de poliacrilamida 12

% (33 %/0,9 % acrilamida/bisacrilamida) preparados em Tris-HCl 400 mM pH 8,8;

contendo 3,3 % de acrilamida; 0,09 % de bisacrilamida; 0,1 % de SDS; 0,075 % de APS e 0,07 % de TEMED. A corrida prosseguiu em tampão de eletroforese para SDS-PAGE a 200 V até o desaparecimento do corante azul de bromofenol. Dois géis foram preparados, um foi corado com azul de Comassie por 10 min sob agitação e descorado overnight com água destilada. Este gel foi usado para determinar a qualidade do extrato proteico antes de realizar a transferência para membranas de nitrocelulose. O outro gel foi utilizado na detecção das proteínas pela técnica de Western blot.

5.8.8. Western blot

Após a separação das proteínas por SDS-PAGE, elas foram transferidas para membranas de nitrocelulose Hybond-ECL (GE) a 100 V por 1 hora (no gelo) ou a 50 V por 16 horas (4 °C) em tampão de transferência utilizando o sistema de transferência da marca Bio-Rad.

Depois da transferência, as membranas foram coradas com Ponceau S até o surgimento das bandas proteicas. As membranas foram lavadas brevemente em água destiladas e incubadas na solução de bloqueio por 1 hora em TA. As membranas foram então incubadas com o anticorpo primário de α-GFP (diluído 1:3.000 na solução de bloqueio) [Anti-GFP (F56-6A1), monoclonal produzido em camundongo anti-IgG2b – Santa Cruz Biotechnology], por 1 hora em TA ou overnight a 4°C sob agitação constante. Em seguida, elas foram lavadas 3 vezes de 5 min. com PBS Tween 20 a 0,05 % e incubadas por 1 hora em TA com o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase (diluído 1:5.000 na solução de bloqueio). As membranas foram lavadas 3 vezes de 5 min com PBS Tween 20 a 0,05 % e reveladas com o kit ECL™ Western Blotting Systems (GE Healthcare), por quimioluminescência em filme radiográfico Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare). O extrato de T. cruzi expressando GFP foi usado como controle positivo (Normanda Souza Melo, comunicação pessoal).

5.8.9. Tratamento dos materiais e soluções para eliminação de RNase

Os reagentes e materiais foram descontaminados segundo Sambrook, Fritsch e Maniatis (1989). A vidraria foi lavada com água destilada e etanol 70 % v/v, secadas e aquecidas a 150°C por 8 horas. Materiais de plástico, que não podiam ser aquecidos como os aparatos de eletroforese, foram lavados com água destilada e etanol 70 %, secados e submersos em solução de H2O2 3 % por 10 min. Após este período, estes materiais foram lavados com água ultrapura e secos a TA.

As soluções foram tratadas com 0,1 % de DEPC por 1 hora a 37 °C. Para eliminar o DEPC, as soluções foram autoclavadas por 15 min. a 120 °C e 1 atm de pressão. No caso de soluções que não podiam ser autoclavadas, seus componentes passaram por este tratamento em separado para só então a solução final ser preparada.

5.8.10. Extração de RNA de Angomonas deanei

O RNA total de A. deanei foi extraído de 5 x 10⁸ protozoários em fase exponencial de crescimento. As células foram centrifugadas a 3.000 rpm por 10 min.

a 4 °C (Eppendorf Centrifuge 5804R) e lavadas duas vezes com PBS 1x gelado. O RNA foi extraído utilizando-se o kit RNAspin Mini RNA Isolation Kit (Qiagen), seguindo recomendações do fabricante. No final da purificação, alíquotas de 3 µL foram separadas para quantificação em Nanodrop^TM (Thermoscientific) e avaliação da qualidade do RNA por eletroforese em gel de agarose desnaturante. As amostras foram estocadas a – 80 °C até o momento do uso.

5.8.11. Eletroforese em gel de agarose desnaturante

As amostras de RNA foram preparadas adicionando-se 3 µL formamida seguido de desnaturação a 65 °C por 10 min. Elas foram então separadas por eletroforese em gel de agarose 1,2 % contendo 2 % de formaldeído. A corrida procedeu em tampão MOPS/EDTA 1x por 1 hora a 80 V, para o gel da análise da qualidade da extração do RNA, ou por 1 h 40 min a 80 V, para o gel de transferência para Northern blot. Os géis foram revelados em solução de brometo de etídio 0,05 % preparada em água tratada com DEPC (item 5.8.9). Após 10 min., os géis foram lavados brevemente com água isenta de RNase e em seguida visualizados sob luz ultravioleta em transluminador (UVP BioImaging Systems EPI Chemi Darkroom), para serem então fotodocumentados.

5.8.12. Northern blot

Os géis preparados como descrito no item anterior foram tratados com solução e NaOH 50 mM isenta de RNase por 4 min sob agitação constante. O gel foi preparado para transferência em membranas de nitrocelulose Hybond-N+ (GE Health Care) por capilaridade em solução de SSC 10x. A transferência ocorreu por 15 horas. Em seguida, as membranas foram expostas à luz ultravioleta em transluminador para efetuar o crosslink do RNA às membranas. Elas foram então submetidas à hibridação com sondas raidiomarcadas (item 5.8.14) ou mantidas a -20°C até o momento do uso.

5.8.13. Southern blot

Em torno de 10 µg de DNA genômico de A. deanei e 1 µg de DNA dos vetores pCDXTub GFP e pCDXRibo GFP foram digeridos em sistemas distintos com as enzimas HindIII e XbaI overnight seguindo protocolo do fabricante (Fermentas).

Uma alíquota das amostras foi separada por eletroforese em gel de agarose 0,8 % (item 5.7.10) para avaliação da qualidade do DNA. As amostras de DNA genômico foram purificadas por precipitação com etanol absoluto (item 5.7.9) e então ressuspensas em 20 µL de água ultrapura. As quantias de 7 µg de DNA genômico e 15 ng de DNA dos vetores digeridos foram separadas por eletroforese de agarose 0,8% (item 5.7.10) por 13 h a 25 V. Após a corrida, os géis foram revelados como descrito no item 5.7.10. Estes foram então tratados em solução de depurinação por 7 min. sob agitação leve e constante. Os géis foram então brevemente lavados em água ultrapura e tratados com a solução de desnaturação por 30 min. também sob agitação. Após este período, os géis foram lavados rapidamente em água ultrapura e tratado com a solução de neutralização por 20 min., sob agitação leve e constante.

Após esses procedimentos, o DNA dos géis foi transferido para membranas de nitrocelulose Hybond-N+ (GE Health Care) como descrito no item 5.8.12. Após a transferência e crosslink do DNA às membranas, estas foram submetidas à hibridação com sondas raidiomarcadas (item 5.8.14) ou estocadas a – 20 °C até o momento do uso.

5.8.14. Marcação de sondas radioativas

O fragmento de Neo foi obtido por reação de PCR com os iniciadores NeoFor e NeoRev (Quadro 6). O fragmento de GFP foi obtido pela digestão do vetor pROCK GFP Neo com as enzimas XbaI e XhoI. Em ambos os casos, os fragmentos foram purificados por excisão do gel de agarose (item 5.7.3) para eliminar a contaminação com DNA genômico ou plasmidial. Em reação de 50 μL, cerca de 80 ng desses fragmentos foram radioativamente marcados com 50μCi de [α-P³²]dCTP, utilizando 5 μL da solução de hexanucleotídeos randômicos como iniciadores, 10 μL do tampão da reação contendo os demais dNTPs não marcados e 2 unidades da enzima Klenow (fragmento), disponível no kit Megaprime DNA labelling System (GE

Healthcare). Após 1 hora de marcação, as reações foram bloqueadas com 25 mM de EDTA pH 8,0.

Após a obtenção das sondas, as membranas foram submetidas à pré-hibridação em aproximadamente 20 mL de solução de pré-pré-hibridação em frascos apropriados mantidos a 65 ºC por 3 horas. Após prévia desnaturação por fervura a 5 min. com 200 mM de NaOH, as sondas marcadas foram adicionadas à solução de pré-hibridação. A reação prosseguiu a 65 °C em forno giratório por aproximadamente 18 horas (CHURCH; GILBERT, 1984). Após hibridação, as membranas foram lavadas duas vezes com solução de lavagem a 65 ºC. Após a lavagem, as membranas foram seladas e expostas em cassete com chapa sensibilizadora (GE Healthcare) e reveladas pelo aparelho STORM860 (Biounit) e em filme de raios X Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare), e reveladas com solução reveladora e fixadora em diferentes tempos de exposição.

Para nova marcação de uma mesma membrana, esta foi lavada com solução de SDS 0,1 % fervente 3 vezes por 10 min. A terceira lavagem procedeu até a solução atingir TA, após os 10 min. de fervura. A membrana foi então lavada brevemente em SSC 2x e exposta por 16 horas em cassete com chapa sensibilizadora para determinar se ainda havia algum sinal radioativo. A chapa foi revelada pelo aparelho STORM860 (Biounit).

5.8.15. Análise da atividade de luciferase

A determinação da atividade de luciferase foi realizada utilizando-se o kit Dual Glo^® Luciferase Assay System (Promega), efetuando-se algumas modificações.

Em torno de 1 x 10⁸ células de A. deanei e de T. cruzi em fase de crescimento exponencial foram centrifugadas a 3.000 rpm por 10 min. (Eppendorf Centrifuge 5804R) e lavadas uma vez com PBS 1x. As células foram novamente centrifugadas para remover o PBS 1x e o sedimento foi ressuspenso em tampão de lise passivo 1x. As células foram lisadas com 3 ciclos de congelamento e descongelamento em nitrogênio líquido e água a 65 °C, respectivamente. Após breve centrifugação para sedimentar os restos celulares, 20 µL do sobrenadante foram transferidos para placa preta de 96 poços (Corning) e fundo chato. Sobre ele, foram adicionados 20 µL do reagente Dual Glo^® Luciferase, seguido de 20 µL do reagente Dual Glo^® Stop Glo, o qual contém coelenterazina, substrato para a reação de RLUC. Após a adição dos

reagentes, a reação foi incubada por 10 min. em TA. Imediatamente depois, a reação foi lida em aparelho Tecan infinite 200, através do software i-control em modo de luminescência por 15 seg. a 24 °C. O extrato de epimastigotas de T. cruzi expressando RLUC foi usado como controle positivo.

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1. ANÁLISE IN SILICO PARA VERIFICAR A EXISTÊNCIA DA MAQUINARIA DE RNAi EM Angomonas deanei

Para analisar a existência da maquinaria de RNAi em A. deanei, o que facilitará a manipulação da expressão de genes neste organismo, o primeiro passo é a identificação de genes codificadores das proteínas atuantes na via clássica: a Ago e a Dicer. Dados genômicos de A. deanei juntamente com os tripanossomatídeos Trypanosoma cruzi cepa DM28, Trypanosoma cruzi clone CL-14, Trypanosoma rangeli, e Blastocrithidia culicis foram gerados utilizando o sequenciamento de DNA de nova geração (454 GS FLX Genome Analyzer – Roche). Este esforço de sequenciamento envolve a colaboração de vários pesquisadores brasileiros e está centralizado no laboratório de bioinformática (Labinfo) do LNCC (Laboratório Nacional de Computação Científica) sob coordenação da pesquisadora Dra Ana Tereza Vasconcelos. No genoma de A. deanei, ainda em fase de anotação, foram encontradas uma provável proteína AGO, uma Dicer e também uma PIWI (Dra.

Adriana Ludwig, comunicação pessoal). O gene que codifica uma provável Dicer de A. deanei foi identificado, mas está incompleto. Por essa razão, essa proteína foi excluída das nossas análises, uma vez que não seria possível concluir se domínios ausentes nesta proteína seriam verdadeiros ou não.

El-Sayed et al. (2005) identificaram, através de análises in silico, a presença de uma provável proteína PIWI no genoma de T. cruzi, o que foi corroborado posteriormente por Garcia-Silva et al. (2010). Essa proteína, nomeada TcPIWI-Tryp, possui um domínio PIWI, além de um subdomínio OB, semelhante ao encontrado no domínio PAZ das argonautas e responsável pela ligação de ácidos nucléicos de fita simples. Essas características foram determinadas por análises que utilizam algoritmos mais complexos que as usuais, devido à baixa conservação do domínio PAZ nestas proteínas AGO/PIWI de eucariotos inferiores (MAKAROVA et al., 2009).

Sendo assim, utilizamos a mesma metodologia para determinar se as prováveis proteínas AGO e PIWI de A. deanei preenchiam os requisitos dessa família de proteínas.

Análises in silico com as prováveis proteínas AGO (aqui nomeada AdAGO) e PIWI (aqui nomeada de AdPIWI) de A. deanei mostram que essas proteínas

possuem cerca de 90 e 116 kDa, respectivamente, apresentando caráter básico (pI ≈ 9), o que também é observado em outras proteínas dessa classe (Revisado por CERUTTI, CASAS-MOLLANO, 2009; GARCIA-SILVA et al.; 2010), que interagem com ácidos nucléicos. A análise com o software SMART (Figura 6) mostrou a existência de um domínio PIWI, que se estende do aminoácido 727 ao 1.024 (AdPIWI) e do 526 ao 866 para a AdAGO. Entre outros domínios com baixa probabilidade, o domínio PAZ também é encontrado em ambas as proteínas (aminoácidos 286 ao 423 para AdAGO, e 409 a 604 para AdPIWI). Para a provável proteína PIWI de A. deanei, o valor esperado para o domínio PAZ foi consideravelmente alto (e-value 3,72 x 10⁴), fora dos parâmetros aceitáveis para a predição (o e-value deve ser muito menor que 1 para apresentar significância estatística). Como comparação, as proteínas AGO e PIWI de T. brucei apresentam para o domínio PAZ e-value da ordem de 10^-23 (dados do sítio SMART). É possível que, tal como descrito para a TcPIWI-Tryp (GARCIA-SILVA et al.; 2010). o domínio PAZ da AdPIWI tenha sido perdido ao longo da evolução, ou que esse organismo tenha uma forma divergente deste domínio, justificando a não detecção deste domínio em análises iniciais.

A análise pelo HHpred da AdAGO e da AdPIWI mostrou homologia com várias estruturas de argonautas de diferentes organismos, na região próxima ao C-terminal, onde se localiza o domínio PIWI (Figura 6). Um subdomínio OB-fold também foi encontrado para AdAGO, com menor probabilidade (e-value 1,2 x 10^-5 para). O OB-fold (OB = ligante de oligonucleotído/oligossacarídeo), é um motivo compacto envolvido no reconhecimento de ácidos nucléicos (THEOBALD; MITTON-FRY; WUTTKE, 2003). Esse subdomínio já foi descrito como parte do domínio PAZ das argonautas (SONG et al., 2004), corroborando a ideia de que a AdAGO e a AdPIWI possuam um domínio PAZ degenerado mas com possível capacidade de ligação a RNA de fita simples (ssRNA) ou DNA de fita simples (ssDNA). Outras regiões, como as repetições RGG no domínio N-terminal, responsáveis pela associação da proteína TbAGO a polirribossomos (SHI; ULLU; TSCHUDI, 2004; SHI et al., 2009) não foram identificadas por estas análises em nenhuma das duas proteínas de A. deanei estudadas.

FIGURA 6 – REPRESENTAÇÃO DAS PROTEÍNAS COM MAIOR HOMOLOGIA ÀS PROTEÍNAS AGO E PIWI DE A. deanei (continua).

NOTA: Em A estão os resultados para AdAGO e em B, para a AdPIWI. Os colchetes à direita indicam os domínios e seus respectivos values encontrados pelo SMART e pelo HHpred, como indicado. E-value: fornece número médio de falsos positivos e representa a confiabilidade do resultado. Se próximo de zero, o resultado é confiável. Escore: somatório dos escores especificados para cada par de letra alinhado, e letras com gaps são tidas como penalidades. Quanto maior seu valor, melhor é o alinhamento. Probabilidade: mostra em porcentagem a probabilidade do resultado ser um verdadeiro positivo, em relação à sequência em análise. Em azul está o domínio N-terminal; em vermelho, o domínio PAZ; em verde, o MID; em marrom, o domínio conector; em roxo o PIWI e em laranja, o subdomínio OB-fold. Os domínios foram identificados pelo sítio SMART, ou pela literatura. Em cinza estão os domínios das proteínas que não puderam ser identificados nestas análises. Os números sob os domínios indicam as posições em relação à AdAGOI (A) e à AdPIWI (B). Desenhado em escala

A

B

aproximada. AGO, argonauta; MBP, proteína ligante de manose; ssDNABP, proteína ligante de ssDNA; NABP, proteína ligante de ácidos nucleicos. P. furiosus = Pyrococcus furiosus; T.

thermophilus = Thermus thermophilus; A. aeolicus = Aquifex aeolicus; H. sapiens = Homo sapiens; D.

melanogaster = Drosophila melanogaster; N. crassa, = Neurospora crassa.

O alinhamento entre as sequências primárias de outras proteínas AGO e PIWI de tripanossomatídeos mostrou conservação de aminoácidos próxima daqueles que supostamente fazem parte da tríade catalítica (Asp-Asp-His) para as proteínas PIWI de A. deanei, T. brucei, T. cruzi e L. braziliensis (Figura 7). Essas proteínas parecem conter o motivo DDH, comum nas argonautas ativas de eucariotos. As proteínas Ago parecem não ter esse motivo usual, como também observado por Garcia-Silva et al. (2010).

FIGURA 7 – ALINHAMENTO MÚLTIPLO ENTRE PARTE DO DOMÍNIO PIWI DAS PROVÁVEIS PROTEÍNAS AGO E PIWI DE ALGUNS TRIPANOSSOMATÍDEOS.

NOTA: Alinhamento realizado pelo programa Prankster Graphical Aligner. No destaque (cinza) são mostrados os prováveis resíduos que constituem a tríade catalítica. Os números entre parênteses

NOTA: Alinhamento realizado pelo programa Prankster Graphical Aligner. No destaque (cinza) são mostrados os prováveis resíduos que constituem a tríade catalítica. Os números entre parênteses