Contagem de estreptococos mutans na placa bacteriana

Como a quantidade de placa bacteriana coletada foi variável, o número de estreptococos do grupo mutans na placa foi estimado com base em sua porcentagem em relação às bactérias anaeróbias e facultativas, que representam a grande maioria dos microorganismos da placa e serão portanto chamadas, a partir desse ponto, de bactérias totais.

4.9.1. Preparo do meio ágar mitis salivarius bacitracina

O meio foi preparado conforme descrito anteriormente.

4.9.2. Preparo do meio ágar sangue brucella suplementado

O ágar sangue brucella suplementado foi preparado a partir do meio base ágar brucella (Difco Laboratories), suplementado com 0,0005% de hemina bovina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA), 0,0001% de menadione (Sigma) e 5% de sangue desfibrinado de carneiro. O preparo do meio foi realizado da seguinte forma: (a) Uma solução de menadione a 0,1% foi preparada pela adição de 10 mg de menadione a 10 mL de etanol absoluto p.a. (Merck)46, 93. A solução foi armazenada em refrigerador a 4 oC. (b) Uma solução de hemina bovina a 0,5% foi preparada pela adição de 50 mg de hemina a 1 mL de uma solução de hidróxido de sódio a 1 N (Merck) e a 9 mL de água destilada93. A solução foi autoclavada a 121oC por 15 minutos46, 93 e armazenada em refrigerador a 4 oC.

(c) 50 mL de sangue de carneiro foram coletados assepticamente em um erlenmeyer de 100

mL contendo pérolas de vidro, previamente esterilizado. Após o controle de esterilidade, o sangue foi armazenado em refrigerador a 4 oC. (d) Para o preparo de 300 mL de meio, 12,9 g de ágar brucella (Difco Laboratories) (fórmula para 1000 mL: Triptona, 10g; peptamina, 10g; glicose, 1g; extrato de levedura, 2g; cloreto de sódio, 5g; bissulfito de sódio, 0,1g; ágar, 15g) foram adicionados em um erlenmeyer de 500 mL contendo 300 mL de água destilada.

FIGURA 6 - (a) Dispositivo intrabucal utilizado, contendo 4 blocos de esmalte bovino cobertos por uma tela plástica. (b) Gotejamento da solução de sacarose a 20% sobre os

O meio foi deixado em repouso à temperatura ambiente por 15 minutos para encharcar o ágar, sendo posteriormente dissolvido em placa aquecedora magnética (Corning), com agitaçãoconstante, até a ebulição. O meio foi removido da placa aquecedora e 0,3 mL da solução de menadione a 0,1% foi adicionado ao erlenmeyer46. A seguir, o meio foi autoclavado a 121 oC por 15 minutos e em seguida resfriado em banho-maria a 45-50 oC. Assepticamente, 0,3 mL da solução de hemina bovina a 0,5% e 15 mL de sangue de carneiro foram adicionados. O meio foi distribuído assepticamente em volumes de 15 a 20 mL em placas de petri descartáveis 90 X 15 mm (Inlab). Após a solidificação, as placas foram incubadas em estufa a 37 oC (Fanem), durante 24 horas, para fazer o controle de esterilidade. O meio de cultura foi armazenado acondicionado em papel filme, em refrigerador a 4 oC, sendo a maioria das placas utilizada em 48 a 72 horas.

4.9.3. Preparo da suspensão de placa bacteriana

A placa coletada dos blocos 2 e 3 foi suspensa em um frasco de vidro de 4 mL com tampa de rosca, contendo 2 mL de solução salina tamponada7, pH 7,4, e 15 a 20 pérolas de vidro de 1 a 2 mm de diâmetro. A suspensão de placa foi agitada em agitador de tubos do tipo “ mixer” (Thermolyne) por 30 segundos, para desagregar as células bacterianas (Figura 7a).

4.9.4. Diluição da suspensão de placa bacteriana

A partir da suspensão de placa bacteriana foram preparadas diluições decimais seriadas (10-1 a 10-6) misturando-se 0,2 mL da suspensão de placa com 1,8 mL de solução salina tamponada esterilizada em um tubo de ensaio 13 X 100 mm. Entre cada diluição os tubos foram agitados em “ mixer” (Thermolyne) por 20 a 30 segundos.

4.9.5. Semeadura e incubação

Para a determinação do número de estreptococos do grupo mutans, volumes de 0,02 mL das diluições 100, 10-1, 10-2 e 10-3 foram semeados em duplicata na superfície de uma placa de petri, contendo o meio ágar mitis salivarius bacitracina. As placas foram incubadas na estufa a 37 oC, durante 48 horas, em atmosfera de microaerofilia obtida pelo método da vela39.

diluições 10-3, 10-4, 10-5 e 10-6 foram semeadas em duplicata na superfície de uma placa de petri, contendo ágar sangue brucella suplementado (Figura 7b). As placas foram incubadas em estufa a 37 oC, em jarras de anaerobiose “GasPak” (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA), contendo os envelopes gerador de CO2 e H2 “ BBL GasPak Plus” e indicador de anaerobiose (Becton Dickinson Microbiology Systems), por 72 a 96 horas.

As amostras de placa bacteriana foram semeadas em um tempo médio de 2 horas após a coleta.

4.9.6. Contagem das colônias

A contagem das colônias foi feita com o auxílio de microscópio estereoscópico (Carl Zeiss do Brasil). Sempre que possível, foram selecionadas, para a contagem, as gotas das diluições com 6 a 60 UFC.

A identificação das colônias de estreptococos mutans foi feita com o auxílio do microscópio estereoscópico e coloração de Gram. As colônias pretas, com 0,5 a 1,0 mm de diâmetro, convexas, com aspecto rugoso, com ou sem a presença de uma gota na superfície, constituídas por cocos gram positivos dispostos em cadeias foram consideradas como colônias típicas pertencentes aos estreptococos do grupo mutans (Figura 5). De cada tipo morfológico de colônia atípica presente em cada placa de MSB foi feito um esfregaço, corado pelo método de Gram, para observação das características morfotintoriais ao microscópio Olympus CBA (Micronal, São Paulo, SP), com objetiva de imersão. Na contagem de estreptococos mutans, foram consideradas as colônias típicas e aquelas que apresentavam crescimento misto de cocos gram positivos e bacilos gram negativos ou positivos. Nenhum método de identificação bioquímica foi utilizado na contagem dos estreptococos mutans.

Os dados foram convertidos em UFC/mL de suspensão de placa, multiplicando-se o número de colônias encontradas por 50 (correção para 1 mL) e pela recíproca da diluição. O número de estreptococos do grupo mutans presente na placa bacteriana foi expresso em porcentagem em relação ao número de bactérias totais.

FIGURA 7 - (a) Agitação, em “mixer”, do frasco com pérolas contendo 2 mL de solução salina tamponada e a amostra de placa bacteriana. (b) Placa de ágar sangue após o