Contagem total - Análise microbiológica da água

4.2 Análise microbiológica da água

4.2.1 Contagem total

Observa-se na tabela 9 os resultados da contagem total de coliformes termotolerantes das análises da água, das vinte e cinco propriedades, durante as estações outono, inverno e primavera.

De acordo com os resultados obtidos nas análises realizadas nota-se que a maioria das águas analisadas estava contaminada com coliformes termotolerantes e que, de acordo com o padrão da legislação vigente, deveria estar ausente. Servindo como importante meio de transmissão de doenças para aqueles indivíduos que a utilizava.

Resultados semelhantes foram verificados por autores como Amaral et al. (2003), que encontraram de 90 a 100% das amostras de água de poços rasos, localizados em áreas urbanas, contaminadas por coliformes termotolerantes, evidenciando, portanto, o risco à saúde da população consumidora deste tipo de água sem nenhum tratamento.

Os pesquisadores Freitas et al. (2001) analisaram a qualidade microbiológica da água em duas regiões do estado do Rio de Janeiro, e concluíram que mais de 50% das amostras de água de poço nas duas áreas apresentaram contaminação por coliformes termotolerantes, tornando a água imprópria para consumo humano. Ressaltaram que todos os domicílios onde amostras de água foram coletadas possuíam poço e ligação no sistema de distribuição de água.

TABELA 9 Contagem total de coliformes termotolerantes nas amostras de água utilizada em propriedades leiteiras.

Contagem Total Coliformes Termotolerantes (NMP/100 mL)

Propriedades Outono Inverrno Primavera

1 0,09 0,21 0,04 2 0,04 < 0,03 < 0,03 3 0,04 < 0,03 0,04 4 0,04 0,04 < 0,03 5 < 0,03 0,04 0,07 6 < 0,03 0,04 0,43 7 < 0,03 4,6 0,09 8 < 0,03 2,4 2,4 9 < 0,03 < 0,03 0,93 10 ≥ 24 < 0,03 < 0,03 11 ≥ 24 0,23 0,09 12 < 0,03 0,15 < 0,03 13 0,07 0,23 < 0,03 14 ≥ 24 < 0,03 < 0,03 15 ≥ 24 0,04 0,43 16 ≥ 24 < 0,03 ≥ 24 17 ≥ 24 < 0,03 < 0,03 18 0,04 0,09 ≥ 24 19 0,43 < 0,03 0,15 20 < 0,03 0,23 < 0,03 21 ≥ 24 < 0,03 0,04 22 0,04 < 0,03 0,43 23 ≥ 24 < 0,03 < 0,03 24 0,04 < 0,03 0,43 25 < 0,03 < 0,03 0,04

Na tabela 10 encontram-se os resultados da contagem total de Pseudomonas sp. das análises da água, das vinte e cinco propriedades, durante as estações outono, inverno e primavera.

TABELA 10 Contagem total de Pseudomonas sp. nas amostras de água utilizada em propriedades leiteiras

Contagem Total Pseudomonas sp (NMP/100 mL)

Propriedades Outono Inverrno Primavera

1 < 1,1 < 1,1 < 1,1 2 < 1,1 3,6 < 1,1 3 6,9 < 1,1 < 1,1 4 < 1,1 < 1,1 < 1,1 5 3,6 2,2 23 6 < 1,1 16,1 > 23 7 3,6 12 > 23 8 5,1 9,2 > 23 9 2,2 5,1 > 23 10 2,2 < 1,1 23 11 5,1 23 < 1,1 12 < 1,1 12 > 23 13 12 16,1 12 14 < 1,1 16,1 16,1 15 > 23 > 23 5,1 16 > 23 6,9 23 17 < 1,1 < 1,1 < 1,1 18 1,1 < 1,1 2,2 19 < 1,1 16,1 3,6 20 9,2 > 23 6,9 21 1,1 16,1 9,2 22 < 1,1 < 1,1 < 1,1 23 > 23 1,1 9,2 24 < 1,1 5,1 16,1 25 9,2 12 16,1

Percebe-se a presença do gênero Pseudomonas em todas as estações estudadas. O gênero Pseudomonas é extremamente importante na indústria leiteira, pois é constituído por espécies capazes de se desenvolver a uma temperatura menor que 7 °C, independentemente da sua temperatura ótima de crescimento. Sob o ponto de vista de deterioração, os microrganismos psicrotróficos são um grupo importante no leite, principalmente porque produzem enzimas que agem sobre os constituintes do leite causando alterações físico-químicas e organolépticas (Shah, 1994).

Observa-se na tabela 11 os resultados da contagem total de Aeromonas sp das análises da água, das vinte e cinco propriedades, durante as estações outono, inverno e primavera.

O gênero Aeromonas fez-se presente em todas as estações do ano, sendo a estação de maior contagem a outono e, pode ser observado na tabela 13.

Os resultados para o Teste de Kruskal-Wallis, com a finalidade de avaliar diferenças significativas entre as estações do ano em relação à contagem de coliformes termotolerantes (Cter), Pseudomonas sp (Cpseu) e Aeromonas sp (Caero) encontram-se na Tabela 12.

O teste de Kruskal-Wallis é um método não paramétrico que foi introduzido por estes autores em 1952, como um competidor ou um substituto do teste F do campo paramétrico. Sua finalidade é estabelecer confronto entre k amostras independentes.

Admitindo k tratamentos (utilizado para delineamentos inteiramente casualizados), o teste permite averiguar se há diferença entre pelo menos dois deles; ou seja, a hipótese de nulidade (H0) seria que os efeitos dos tratamentos

são iguais. É, portanto, um teste de posição para k amostras independentes. Em caso da detecção de diferença entre efeitos de pelo menos dois tratamentos, pode ser empregado o método das comparações múltiplas, que serve como complementação do teste de Kruskal-Wallis.

TABELA 11 Contagem total de Aeromonas sp. nas amostras de água utilizada em propriedades leiteiras

Contagem Total Aeromonas sp (UFC/mL)

Propriedades Outono Inverrno Primavera

1 5,5 x 105 ₀ ₀ 2 1,4 x 105 ₀ ₀ 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 4,5 x 102 ₀ 7 0 0 0 8 0 0 0 9 0 2,7 x 102 ₀ 10 8,0 x 105 ₀ ₀ 11 1,4 x 105 _{6,6 x 10}2 _{2,1 x 10}3 12 0 0 0 13 0 0 0 14 1,3 x 104 ₀ ₀ 15 8,9 x 104 ₀ ₀ 16 1,6 x 104 ₀ ₀ 17 0 0 0 18 5,8 x 103 0 5,0 x 102 19 0 0 7,6 x 102 20 0 0 0 21 0 0 0 22 0 0 0 23 2,7 x 103 ₀ ₀ 24 0 0 8,7 x 102 25 0 0 0

O gênero Aeromonas fez-se presente em todas as estações do ano, sendo a estação de maior contagem a outono e, pode ser observado na tabela 13.

Vale salientar, porém, que os processos não paramétricos, quase sempre são menos eficientes do que seus concorrentes do campo paramétrico (Campos, 1983).

Portanto as técnicas não paramétricas devem ser empregadas quando as suposições distribucionais necessárias para aplicação de uma técnica clássica não são satisfatoriamente atendidas, por exemplo, quando não for possível o cumprimento das pressuposições de normalidade dos resíduos, homogeneidade das variâncias de tratamentos.

TABELA 12 Resumo do teste de Kruskal - Wallis do logaritmo da contagem de Coliformes termotolerantes (log(NMP/100mL)), Pseudomonas sp. (log(NMP/100mL)), e Aeromonas sp. (log(UFC/mL)) de acordo com a época do ano para o ensaio com água utilizada na produção leiteira na micro-região de Lavras-MG

Qui-Quadrado Tratamentos G.L.

Cter Cpseu Caero

Épocas 2 3,4400 4,4655 7,1811*

(*) significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis

Não houve diferença significativa entre as três estações do ano em relação à contagem de coliformes totais, coliformes termotolerantes e Pseudomonas sp. Entretanto, pode-se afirmar com significância de 5% que houve diferença estatística significativa, entre as estações do ano, para a contagem total de Aeromonas sp. Isto, pode ser melhor observado na tabela a seguir.

Na Tabela 13 encontram-se os resultados do logaritmo da contagem média de Coliformes termotolerantes (log(NMP/100mL)), Pseudomonas sp. (log(NMP/100mL)), e Aeromonas sp. (log(UFC/mL)) de acordo com a época do ano para o ensaio com água utilizada na produção leiteira na micro-região de Lavras-MG.

TABELA 13 Resultados do logaritmo da contagem média de Coliformes

termotolerantes (log(NMP/100mL)), Pseudomonas sp.

(log(NMP/100mL)), e Aeromonas sp. (log(UFC/mL)) de acordo com a época do ano para o ensaio com água utilizada na produção leiteira na micro-região de Lavras-MG.

Médias seguidas de mesma letra na linha não diferem entre si em nível de 5% de probabilidade, pelo teste não paramétrico de Comparações Múltiplas.

Pelo teste não paramétrico de Comparações Múltiplas, pode-se afirmar em nível de 5% de probabilidade, que a estação com maior média de contagem total para Aeromonas sp. foi o outono, e que as médias das outras estações do ano não foram consideradas estatisticamente diferentes.

Por ser o outono uma estação de transição entre o verão e inverno, verifica-se característica de ambas. A temperatura é muito variada oscilando de 15 a 25ºC. Aliado às chuvas intensas no período que antecedia a estação outono (início de março), tornando a água uma carreadora de excretas humanas e animais e matéria orgânica. Portanto, fornecendo condições de crescimento e desenvolvimento para este microrganismo (Figura 1). Isso explica a maior média de contagem total de Aeromonas sp. nessa época do ano.

Log da contagem Média

Outono Inverno Primavera

Coliformes Termotolerantes -0,4804 a -1,1532 a -0,8676 a Pseudomonas sp 0,4480 a 0,6980 a 0,7996 a Aeromonas sp 1,7344 a 0,3156 b 0,4728 b

Ano 2006 (Dias)

Outono Inverno Primavera

0 50 100 150 200 250 300 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 P re c ip it a ç ã o ( m m ) T e m p e ra tu ra M é d ia ( ºC )

FONTE: Estação Metereológica da Universidade Federal de Lavras / UFLA (2006)

FIGURA 1 Dados de Precipitação (mm) e de Temperatura Média (·C) diária das estações Outono, Inverno e Primavera.

Temperatura Média (ºC) Precipitação (mm)

4.2.2 Escherichia coli

Na Figura 2 encontram-se os resultados quanto à presença de E. coli nas amostras de água analisadas de acordo com as estações do ano outono, inverno e primavera. Verificou-se a presença de E. coli em (18,46 %) no outono, (55 %) no inverno e (46,15%) na primavera. 18,46% 55% 46,15% 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00%

Outono Inverno Primavera

FIGURA 2 Presença de E. coli, em porcentagem, nas amostras de água utilizada em propriedades leiteiras na micro-região de Lavras-MG analisadas nas estações outono, inverno e primavera

Pela Portaria nº 518 (Brasil, 2004), que trata do controle de qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, em amostras individuais procedentes de poço, fontes, nascentes, sem distribuição canalizada,

tolera-se a presença de coliformes totais na ausência de E. coli e/ou coliformes termotolerantes em 100 mL.

Desta forma essas águas encontravam-se, em sua maioria, fora dos padrões de potabilidade exigidos pela Portaria nº 518 e, portanto, imprópria para consumo humano, servindo como importante veículo na transmissão de enfermidades ao homem.

Resultados semelhantes foram encontrados por Mallet et al. (2006), onde verificaram que em 100% das amostras de água de propriedades rurais (poço ou nascente), 68 % não se encontravam dentro dos padrões estabelecidos pela Portaria nº 518 (Brasil, 2004), para coliformes termotolerantes, havendo a presença de Escherichia coli em 24% das amostras.

Este resultado é compatível com o encontrado por Kottwitz & Guimarães (2003) que evidenciaram em poços artesianos a presença de coliformes totais em 74,18% das amostras e em 34,28% a presença de coliformes termotolerantes.

Um percentual maior foi detectado por Silva et al., (2005), que analisaram a qualidade bacteriológica da água de 16 poços da cidade de Fortaleza, verificando em (53,4%) das 60 amostras a presença de Escherichia coli, o que é muito preocupante, uma vez que essa bactéria é exclusivamente de origem fecal.

Os resultados para o teste de hipótese para igualdade entre as proporções das épocas quanto à presença de E. coli no ensaio com água em propriedades leiteiras encontram-se na Tabela 14.

TABELA 14 Teste de Hipótese para igualdade entre as proporções das épocas quanto à presença de E. coli no ensaio com água em propriedades leiteiras na micro-região de Lavras-MG

Testes Épocas Proporção zcalculado

Outono 0,1846 1 Inverno 0,5500 4,2519** Outono 0,1846 2 Primavera 0,4615 3,3758** Inverno 0,5500 3 Primavera 0,4615 0,9883 (ns)

(ns), (**) respectivamente não significativo e significativo em nível de 1% de probabilidade.

Percebe-se que as proporções das estações outono - inverno e outono - primavera foram consideradas estatisticamente diferentes em nível de 5% de significância. Ou seja, as proporções quanto à presença de E. coli nas estações inverno e primavera foram maiores que a do outono. Entretanto, as proporções de inverno – primavera não foram consideradas estatisticamente diferentes em mesmo nível de significância.

Nota-se que o maior número de isolados de E. coli ocorreu nas estações inverno e primavera. Ao passo, que a de menor número foi outono. De maneira inversa, o número de isolados de Pseudomonas aeruginosa foi maior no outono e decresceu consideravelmente nas estações seguintes. Essa inter-relação pode ser atribuída ao fato da Pseudomonas aeruginosa produzir uma substância capaz de inibir o crescimento da E. coli, ou seja, seu crescimento seria inibido por falta de nutrientes.

Guilherme et al. (2000), em seus trabalhos citam que por interferência da P. aeruginosa que produz uma substância denominada Pseudocin (PLS) que

inibe o crescimento de E. coli, muitas dessas águas consideradas próprias para consumo humano poderiam apresentar um maior grau de contaminação.

Observa-se na Figura 1, no final da estação inverno e durante toda a primavera a presença de chuvas intensas e constantes. Fato que poderia explicar a maior presença de E. coli nesses períodos. Uma vez que, a água de escoamento superficial, durante o período de chuva, é o fator que mais contribui para a mudança da qualidade microbiológica da água.

González et al (1987), em estudo realizado no México, concluíram que a presença de coliformes nas amostras das águas dos mananciais estudadas e dos domicílios teve relação direta com a presença de chuva, devido ao arraste de excretas humanas e animais.

4.2.3 Pseudomonas aeruginosa

Na Figura 3 encontram-se os resultados quanto à presença de Pseudomonas aeruginosa nas amostras de água analisadas, de acordo com as estações do ano outono, inverno e primavera. Verificou-se a presença de Pseudomonas aeruginosa em (12%) no outono, (3,12%) no inverno e (0%) na primavera.

12% 3,12% 0% 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12%

Outono Inverno Primavera

FIGURA 3 Presença de Pseudomonas aeruginosa, em porcentagem, nas amostras de água utilizada em propriedades leiteiras na micro- região de Lavras-MG analisadas nas estações outono, inverno e primavera.

A presença de P. aeruginosa, apenas, não é capaz de condenar o uso da água para consumo humano. Visto que, a legislação vigente no Brasil, a Portaria nº 518 (Brasil, 2004), somente baseia-se na contagem do grupo coliformes, em especial E. coli. Desta forma, amostras de água com presença de P. aeruginosa e ausência de coliformes termotolerantes ou E. coli, são consideradas satisfatórias e próprias para consumo.

No entanto, a espécie P. aeruginosa trata-se de um patógeno oportunista e secundário, em potencial, acometendo principalmente aqueles indivíduos mais debilitados. Além disso, este grupo tem aparecido com freqüência em análises

de águas cloradas e não cloradas, demonstrando que pode resistir inclusive ao processo de cloração. Guilherme et al. (2000) encontraram P. aeruginosa em 31,6 % e 86,6 % de amostras de águas cloradas e não cloradas, respectivamente.

Resultados semelhantes foram encontrados por David et al. (1999) analisando amostras de águas tratadas do Estado de Recife detectaram a presença de P. aeruginosa em 33 % das amostras.

Dados de trabalho de Ávila et al. (1995) apresentam semelhantes resultados em água de consumo comercializada na cidade de Florianópolis, onde foi encontrada em 85 % das amostras a presença de Pseudomonas aeruginosa.

Dentro da cadeia leiteira, a P. aeruginosa pode acarretar alterações nos componentes protéicos e lipídico do leite por meio da atuação de suas enzimas proteases e lípases, respectivamente, acarretando uma diminuição da qualidade do produto final conferindo-lhe sabor amargo, ranço, frutado e coagulando a caseína.

Os resultados para o teste de hipótese para igualdade entre as proporções das épocas quanto à presença de Pseudomonas aeruginosa no ensaio com água em propriedades leiteiras encontram-se na Tabela 15.

Percebe-se que, as proporções das estações outono – inverno, outono – primavera e inverno - primavera foram consideradas estatisticamente diferentes, em nível de significância de 5%. Ou seja, pode-se afirmar que a estação com o maior número de isolados da espécie P. aeruginosa foi outono e a menor foi primavera.

TABELA 15 Teste de Hipótese para igualdade entre as proporções das épocas para contagem de Pseudomonas aeruginosa no ensaio com água em propriedades leiteiras na micro-região de Lavras-MG.

Testes Épocas Proporção zcalculado

Outono 0,1200 1 Inverno 0,0313 2,2545 * Outono 0,1200 2 Primavera 0,0000 3,3798 ** Inverno 0,0313 3 Primavera 0,0000 1,6907*

(*), (**) respectivamente significativo em nível de 5% e 1% de probabilidade.

A espécie Pseudomonas aeruginosa pode crescer e desenvolver-se em ampla faixa de temperatura, independente da sua temperatura ótima de crescimento. A estação outono por apresentar uma ampla variação de temperatura, uma vez que, encontra-se em transição entre as estações verão e inverno pode permitir condições térmicas ótimas ao desenvolvimento da espécie. Ainda, por chover menos nessa época do ano existe a possibilidade destes nutrientes estarem concentrados, e consequentemente, mais disponíveis. Sendo facilmente utilizados por estes microrganismos em seu metabolismo. Um outro fator é a capacidade dessa espécie e, de forma em geral, do gênero Pseudomonas, da formação de película de aderência conhecida como biofilme. Este poderia estar presente nos reservatórios, equipamentos e utensílios de ordenha permitindo assim a permanência desse microrganismo em contato com a água e, consequentemente, maior contaminação dessa água na primeira repetição (outono), em função, principalmente, da falta de higienização periódica dos reservatórios de água.

Eiroa & Junqueira (1996) afirmam que a presença de P. aeruginosa em tubulações e reservatórios pode ser esperada considerando que algumas espécies

apresentam a tendência à adesão em superfícies, provavelmente devido à produção de exopolissacarídeo com propriedades aglutinantes.

Entretanto, ainda que indiretamente, orientações relativas às condições de higiene e, principalmente, sobre um adequado programa de higienização aos proprietários desses reservatórios no momento da coleta da água, pode ter contribuído para a diminuição desses microrganismos nas estações seguintes.

4.2.4 Aeromonas hydrophila

Na Figura 4 encontram-se os resultados quanto à presença de Aeromonas hydrophila nas amostras de água analisadas, de acordo com as estações do ano outono, inverno e primavera. Nota-se a presença de A. hydrophila em (2,12%) no outono, (0%) no inverno e (20,8%) na primavera.

O gênero Aeromonas é primariamente autóctone do ambiente aquático. São comuns e amplamente difundidas no habitat aquático.

Além disso, tem sido reportada significante correlação entre o conteúdo de matéria orgânica e o número total de Aeromonas na água (Viera et al., 2003). A Aeromonas hydrophila é caracterizada, dentro do gênero, como a espécie que apresenta o maior potencial de patogenicidade (Cahill, 1990) e a mais frequentemente incriminada em infecções humanas (Ko & Chuang, 1995). Brandi et al., (1996) demonstraram que esta espécie é capaz de sobreviver por longo período de tempo (140 dias), mantendo, inclusive, suas propriedades virulentas.

2,12% 0% 20,18% 0% 5% 10% 15% 20% 25%

Outono Inverno Primavera

FIGURA 4 Presença de Aeromonas hydrophila, em porcentagem, nas amostras de água utilizada em propriedades leiteiras na micro-região de Lavras-MG analisadas nas estações outono, inverno e primavera.

Sendo a água, amplamente utilizada para consumo humano e para a produção leiteira, cuidados quanto à presença desse microrganismo devem ser levados em consideração. Há relatos de sua presença inclusive em águas cloradas.

O isolamento de A. hydrophila de águas cloradas tem sido documentado por vários autores, sugerindo que algumas espécies deste gênero podem ser menos sensíveis ao cloro quando comparadas com os coliformes, pois já foi isolada de águas com padrões microbiológicos aceitos pela legislação (Eneroth et al., 2000).

Rossi et al. (2000) avaliando a qualidade microbiológica de águas de poços utilizadas em um matadouro bovino, verificaram a presença do gênero Aeromonas em (33%) das amostras analisadas, sendo (2,2%) confirmadas como Aeromonas hydrophila.

Mallet et al. (2006), em trabalho realizado avaliando a qualidade da água em propriedades rurais, encontraram a presença de Aeromonas sp. em 12 % das amostras analisadas, sendo 4 % confirmadas de Aeromonas hydrophila.

Sabe-se que, a qualidade higiênico-sanitária da água é avaliada pela presença de microrganismos indicadores, em especial os coliformes. Dessa forma, águas utilizadas para consumo humano e para diversos fins podem ser caracterizadas como de boa qualidade, ou seja, própria para consumo segundo a legislação atual, Portaria nº 518 (Brasil, 2004), e ainda assim, conter bactérias do gênero Aeromonas, e em especial A. hydrophila, o que a torna inadequada ao consumo humano e, algumas vezes, ao uso a que se destina.

Os resultados para o teste de hipótese para igualdade entre as proporções das épocas quanto à presença de Aeromonas hydrophila no ensaio com água em propriedades leiteiras encontram-se na Tabela 16.

Nota-se que, as proporções das estações outono - primavera e inverno - primavera foram consideradas estatisticamente diferentes em nível de significância de 5% . Não existem evidências estatísticas para afirmar que as proporções das estações outono - inverno foram diferentes em mesmo nível de significância. Ou seja, pode-se concluir que a estação com o maior número de isolados da espécie A. hydrophila foi a primavera.

TABELA 16 Teste de Hipótese para igualdade entre as proporções das épocas para contagem de Aeromonas hydrophila no ensaio com água em propriedades leiteiras na micro-região de Lavras-MG

Testes Épocas Proporção zcalculado

Outono 0,0213 1 Inverno 0,0000 0,5101 (ns) Outono 0,0213 2 Primavera 0,2083 3,4624** Inverno 0,0000 3 Primavera 0,2083 1,7039*

(ns), (*), (**) respectivamente não significativo e significativo em nível de 5% e 1% de probabilidade.

Durante a primavera, nas regiões sudeste, de modo em geral, as chuvas passam a ser mais intensas e freqüentes, marcando o período de transição entre a estação seca e a estação chuvosa. Neste mesmo período, iniciam-se as pancadas de chuva no final da tarde ou noite, devido ao aumento do calor e da umidade que se intensificam gradativamente no decorrer desta estação. Nesta época do ano a temperatura tende a aumentar, chegando à faixa de crescimento ideal para o desenvolvimento da A. hydrophila (Figura 1).

Segundo Vieira (2003), o aumento do número de isolamentos de Aeromonas nos países do hemisfério norte ocorre, particularmente, nas estações de primavera e verão e, em áreas de clima tropical, sua prevalência aumenta durante o verão (variação sazonal dependente da temperatura).

Sendo assim, o maior número de isolamento de A. hydrophila durante a primavera pode ser explicado, pela manutenção de temperaturas relativamente altas nessa época, aliada às chuvas intensas do fim de tarde com o conseqüente

No documento DISSERTAÇÃO_Quantificação e identificação de Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa e Aeromonas hydrophila em água de propriedades leiteiras (páginas 44-76)