Contaminação do sêmen

Um dos grandes entraves para a coleta de sêmen de qualidade é a contaminação, que ocorre principalmente no momento da extrusão. Conforme citado anteriormente, a eliminação de fezes e urina realizada com uma leve compressão na região peritoneal reduzem os riscos de contaminação, entretanto, em muitas espécies, observa-se a eliminação do sêmen juntamente com urina, pois ambos são eliminados por um único poro uro-genital. Nessas espécies, freqüentemente amostras de sêmen podem apresentar contaminações com urina (SHIMODA, 2004; COSSON, 2004).

É constatado que peixes de água doce são hiper-osmóticos em relação à água doce e a eliminação de urina é um dos principais mecanismos de osmo-regulação, compensando a entrada passiva de água. Em tilápia do Nilo, cultivada em ambientes dulcícolas, observa-se grande produção de urina, dificultando, inclusive, a coleta de sêmen.

A urina em algumas espécies de peixe possui baixa osmolaridade e acaba ativando a motilidade espermática, devido à sua baixa concentração osmótica (PERCHEC-POUPARD et al., 1998; DREANNO et al., 1998). Além disso, parte das reservas de ATP intracelular pode ser utilizada (PERCHEC-POUPARD et al., 1998), o que pode resultar em menor sobrevivência de espermatozóides após o processo de criopreservação (OGIER DE BAULNY, 1997). Os efeitos negativos da contaminação

19 por urina em amostras seminais também são constatados no bagre europeu, Silurus glanis (BILLARD et al., 1997; LINHART et al., 1987 e 2004a).

Devido aos inconvenientes supra citados, diversas metodologias têm sido adotadas com o intuito de evitar ou contornar a contaminação do sêmen com urina, incluindo a técnica de coleta de sêmen com o auxílio de cateteres (GLOGOWSKI et al., 2000), que são inseridos diretamente no lúmen testicular, como é o caso de salmonídeos. Entretanto, essa técnica nem sempre é factível visto que em peixes a morfologia da papila nem sempre é compatível para a inserção de cateteres. No caso de linguado, é possível a inserção de um cateter para a na uretra e eliminar a parte da urina presente na bexiga (DREANNO et al., 1998; PERCHEC-POUPARD et al., 1998).

Esta técnica, porém, geralmente aumenta o nível de estresse do animal, além de causar irritação nas áreas cateterizadas.

Outra técnica mais drástica de obter sêmen isento de contaminação é a coleta de sêmen testicular precedida do sacrifício dos animais (GRAFF e JANSSEN, 1996;

KOPEIKA et al., 2003; RIBEIRO e GODINHO, 2003). Esta técnica é mais utilizada em peixes que apresentam testículo de pequeno tamanho (índice gonadossomático < 1%;

ex. Clarias gariepinus; Silurus glanis), ou em peixes de tamanho reduzido, em que a extrusão para a coleta de sêmen se torna difícil de ser realizada (ex. espécies ornamentais).

Em tilápias, o poro uro-genital de tamanho reduzido impossibilita a introdução de cateteres, e, no momento da extrusão, observa-se grande presença de urina. Para contornar esse inconveniente, HARVEY (1983) realizou a extrusão de machos de tilápia do Nilo em um recipiente contendo uma solução de alta osmolaridade. Apesar da re-imobilização dos espermatozóides ser uma técnica factível, ocorre um decréscimo da quantidade de ATP intracelular (COSSON, 2004). Outro inconveniente seria a presença da urina juntamente com a amostra de sêmen, o que tenderia a aumentar o volume (reduzindo a concentração de espermatozóides) e a deteriorar a qualidade da amostra.

20 2.6.3 Efeito da salinidade na qualidade seminal

Peixes eurialinos cultivados em águas salinas foram estudados por diversos autores. LABBE e MAISSE (2001), trabalhando com truta marrom (Salmo trutta f.

fario), compararam a qualidade seminal em animais mantidos em água doce e salgada, observando que a motilidade espermática foi inferior (55 ± 29%) e mais variável quando comparada com o grupo mantido em água doce (89 ± 7%), entretanto não encontrou diferenças na composição celular. Não houve também diferença no processo de criopreservação e os autores concluíram que a salinidade não é um fator determinante da qualidade espermática.

Em tilápias, LINHART et al. (1999) observaram um acréscimo na concentração espermática, inversamente proporcional ao volume.

LANDERGREN e VALLIN (1998), realizaram a fertilização e incubação em diferentes salinidades, observando melhores resultados em salinidades de 0 e 2‰.

LEE et al. (1992), fazendo induções em tainhas (Mugil cephalus) em águas salgada e salobra, observaram melhores resultados em água salgada (32 - 34‰).

Observaram também que a motilidade não era iniciada em salinidades menores que 13‰ e os melhores resultados foram encontrados em salinidades maiores que 17‰.

HADDY e PANKHURST (2000) trabalhando com Acanthopagrus butcheriem sob diferentes salinidades observaram que a motilidade espermática era nula em salinidade 5‰. A 20‰, a motilidade iniciava imediatamente, chegando a mais de 5 minutos. A 35‰, a motilidade iniciava-se rapidamente, entretanto, houve uma queda brusca de motilidade após 2 minutos. Esses dados indicam que o ponto ótimo de salinidade gira em torno de 20‰, pois nessa salinidade a taxa de fecundação também foi otimizada.

21 2.7 CONSERVAÇÃO DO SÊMEN

2.7.1 Refrigeração

O sêmen de peixes pode ser conservado em diversas maneiras, incluindo a simples refrigeração, a liofilização e criopreservação.

A refrigeração é o processo mais simples e pode ser realizada com a simples coleta do sêmen e posterior estocagem no refrigerador, ou caixa isotérmica contendo gelo, mantendo-se a temperatura em torno de 0 a 4ºC. O sêmen coletado pode ser estocado puro, sem diluição, ou então diluído, utilizando-se solução diluidora ou

“extender”. A diluição aumenta a disponibilidade de oxigênio para as células e também reduz a concentração de proteínas do plasma seminal que podem degenerar com o tempo, comprometendo a qualidade seminal (BILLARD e COSSON, 1992; PADHI e MANDAL, 2000).

Existem várias soluções diluidoras, compostas basicamente por sais e tampões, conforme pode ser observado na tabela 2. Essa solução diluidora também costuma ser utilizada como solução imobilizadora para atenuar os efeitos da contaminação por urina, podendo, inclusive, reimobilizar os espermatozóides natantes devido ao aumento da osmolaridade (LINHART et al., 2005; BILLARD e ZHANG, 2001).

22 Tabela 2. Principais soluções diluidoras (extender) utilizadas em peixes teleósteos Solução diluidora Componentes Espécie utilizada Referência

NaCl NaCl 1,2% Brycon insignis SHIMODA (2004)

trealose Trehalose Cyprinus carpio WARNECKE e PLUTA

(2003)

para Silurus Glanis 200mM NaCl; 30mM

Tris-HCl Silurus glanis LINHART et al. (2005)

Solução diluidora de

Cyprinus carpio HORVATH et al. (2003)

Solução diluidora para manter a integridade das células, como oxigênio (MAGYARY et al., 1996, BENCIC et al., 2000), antibióticos (MANSOUR et al., 2004; BILLARD et al., 2004), e substratos energéticos (OGIER DE BAULNY et al., 1999).

23 Tabela 3. Alguns protocolos de estocagem de sêmen à curto prazo, sob refrigeração.

Espécie Solução diluidora Tempo de

estocagem Referência

0,2% glutationa; 4,27% sucrose) 40 dias DEGRAF e BERLINSKY (2004)

Tilápias Sem diluição 5 dias CHAO et al. (1987)

Urechis unicintus Sem diluição 6 dias KANG et al. (2004ª)

Polyodon spathula 150mM NaCl; 5000 U.I. penicilina;

5 mg/mL streptomicina 56 dias BROWN and MIMS (1995)

P. spathula 100m glicose; 20mM Tris 72h LINHART et al. (1995)

S. platorhynchus 150mM glucose; 20mM Tris 72h LINHART et al. (1995) Anguilla japonica 1,3mM CaCl₂; 139,5mM NaCl;

1,6mM MgCl₂; 25mM KCl 28 dias OHTA e IZAWA (1996)

Prochilodus lineatus Sem diluição 20h (30% motilidade) MARQUES e GODINHO (2004) Leporinus friderici Sem diluição 7h (30% motilidade) MARQUES e GODINHO (2004)

Além dos fatores externos, como a temperatura e a composição da solução diluidora, o tempo de estocagem varia de acordo com a espécie. Em piabanha, o tempo de estocagem do sêmen não diluído e conservado em gelo foi de 7,42h, valor semelhante ao observado por MARQUES e GODINHO (2004) para espécies do gênero Leporinus. Em Melanogrammus aeglefinus e Gadus morhua, observou-se motilidade até 20 dias e uma diluição de 1:3 incrementou essa característica para até 40 dias (DeGRAF and Berlisky, 2004). Utilizando-se antibióticos e refrigeração, BROWN e MIMS (1995) observaram motilidade espermática em “paddlefish” por até 56 dias.

Ainda no tocante à refrigeração, KOTEESWARAN e PANDIAN (2002) mantiveram sêmen “post-mortem” de Heteropneustes fossilis sob refrigeração (-20ºC) por até 240 dias, sendo o peixe sacrificado e diretamente conservado em “freezer”, apresentando, inclusive, motilidade e capacidade fecundante. Resultados semelhantes foram encontrados em outras espécies tais como Labeo rohita (ROUTRAY et al.,

24 2006), Hemigrammus caudovitattus (DAVID e PANDIAN, 2006), e Puntius conchonius (KIRANKUMAR e PANDIAN, 2004).