CONTROLE ANALÍTICO

4.9.1. Determinação cromatográfica de hidrocarbonetos

4.9.1.1. Cromatografia gasosa com detector por ionização em chama (FID)

Tanto a caracterização da gasolina, como a quantificação do teor de BTX transferidos para a fase aquosa, foi realizada no Laboratório de Análise de Combustíveis (LACAUTets), utilizando-se um cromatógrafo Varian, modelo CP3800. As principais condições foram: coluna (100m x 0,25 mm) CP-SIL PONA CB (metilpolisilicona), temperatura do injetor: 200 ºC; volume injetado 1,0 µL, pressão da coluna de 49,5 psi.

Programa de temperatura: 35 ºC por 15 min, rampa de 1 ºC min^-1 até 60 ºC, patamar de 20 minutos, rampa de 1 ºC min^-1 até 200 ºC e patamar de 200 min, temperatura do detector por ionização em chama (300ºC).

A análise detalhada da gasolina foi realizada por DHA (Detailed Hydrocarbon Analysis), que permite o reconhecimento das substâncias pertencentes à gasolina através de um procedimento de calibração interna. Para a calibração do programa DHA injetou-se um padrão de referência qualitativa de nafta (supelco), com 89 picos conhecidos nas condições cromatográficas exigidas. Comparou-se a seqüência da eluição apresentada pelo padrão com a seqüência apresentada de uma amostra de gasolina analisada pelo DHA, ajustando-se os tempos de retenção. Muitos desajustando-ses picos identificados foram então fixados na tabela de referência para que o reconhecimento automático fosse efetuado.

A determinação da concentração de benzeno, tolueno e xilenos foi realizada a partir do método do padrão externo. Curvas analíticas individuais foram preparadas a partir de uma solução estoque de 30 mg L^-1 de benzeno, tolueno e xilenos, utilizando-se hexano como solvente. As soluções estoque foram guardadas em vidro âmbar a 4 ºC, para evitar volatilização.

Para a determinação dos BTEX perdidos por volatilização os hidrocarbonetos foram adsorvidos em carvão ativado e determinados por cromatografia gasosa, após extração em

dissulfeto de carbono. Todas as análises foram realizadas junto ao Centro Integrado de Tecnologia e Educação Profissional (SENAI - Curitiba-PR), utilizando-se cromatógrafo Varian, modelo CP3800, com detector de ionização em Chama. Condições: coluna CGE BP-5 (5% fenil, 95% dimetilsiloxano), temperatura da coluna 35 °C por 4 min, aquecimento a 140°C com rampa de 10°Cmin^-1, e permanência a 140 °C por 0,5min.

Temperatura do detector: 300 °C; temperatura do injetor: 220 °C e injeção split1/20.

Metodologia baseada na Norma DIN 38407 F9(1991).

A curva analítica foi elaborada entre 0,01 e 0,5 µg mL^-1, por diluições convenientes de um padrãode 20 mg L^-1 de BTEX em dissulfeto de carbono.

4.9.1.2. Cromatografia gasosa (sistema headspace)

Todas as etapas de determinação dos compostos orgânicos voláteis (benzeno, etilbenzeno, tolueno e xilenos – BTEX) foram realizadas junto ao Centro Integrado de Tecnologia e Educação Profissional (SENAI - Curitiba-PR). As amostras, em fase aquosa ou sólida, foram analisadas por cromatografia gasosa (sistema headspace), utilizando-se de um cromatógrafo Varian, modelo CP3800, com amostrador automático. Condições: coluna DB-624 (6% cianopropilfenil 94% dimetilpolissiloxano), temperatura inicial 40 ºC por 4 min, rampa de aquecimento 10 ºCmin^-1, temperatura final 140 ºC (1min), volume injetado 500 µL com splite de 10, Detector: ionização de Chama.

Para o headspace foi utilizado um tempo de incubação de 30 minutos, sob agitação, a temperatura de 70 ºC. A curva analítica foi elaborada a partir de um padrão certificado, contendo a mistura de benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (BTEX) em metanol, na faixa de concentração compreendida entre 5 e 2000 µg L^-1. Estas curvas foram regularmente verificadas por um padrão e uma carta de controle, aceitando-se um desvio de 15 % como limite de intervenção. O limite de quantificação foi estabelecido em 5 µg L^-1, enquanto que os coeficientes de variação observados (análise em triplicatas) foram de 2%, 8%, 8%, 10% e 13%, para benzeno, tolueno, etilbenzeno, m,p-xileno e o-xileno, respectivamente.

4.9.1.3. Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

Para viabilizar a análise por cromatografia gasosa associada à espectrometria de massas, os hidrocarbonetos foram extraídos por meio de uma rotina de extração líquido-líquido, assistida por efeito “salting out”. Inicialmente, em amostras de 15 mL de solução aquosa adicionou-se NaCl(s) até saturação. Posteriormente, as amostras foram extraídas

com 3 porções de 5 mL de diclorometano. As fases orgânicas foram reunidas, secas com sulfato de sódio anidro e levadas eté volume final de 1 mL em rotaevaoprador. Para validação desta metodologia, foram realizados testes preliminares com soluções aquosas de benzeno, calculando-se uma eficiência média de recuperação de 80 %.

Em estudos envolvendo amostras de solo a extração foi efetuada a frio, colocando-se em contato por agitação orbital amostras de 5 g de solo e 25 mL de diclorometano. Após extração as amostras foram filtradas em papel de filtro quantitativo. O fator de recuperação determinado paran esta condição de extração foi > 85%.

As determinações cromatográficas envolvendo a fração aquosa contendo hidrocarbonetos não voláteis foram realizadas no Laboratório de Análise de Combustíveis (LACAUTets), utilizando-se um cromatógrafo à gás marca Varian (modelo CP3800), equipado com um detector de massas (modelo SATURN 2000). Uma coluna 100 m x 0,25 mm CP-SIL PONA CB (metilpolisilicona) foi utilizada em todas as análises. O fluxo do gás carreador (He) foi mantido constante durante o processo (2 mL min^-1). Para as análises o injetor foi aquecido a 250 ^oC, o “split” razão 1:200, quantidade de amostrada injetada 0,5 µL, pressão na coluna: 49,5 psi, gás de arraste: hélio a 2,0 mL min^-1 na temperatura de 35 ºC. Temperatura “manifold” 120 ^oC e “transfelline” 200 ^oC e do íon trap 170 ºC e modulação axial: 4V. Modo de ionização por impacto de elétrons: 60 eV. O programa de temperatura do forno foi o seguinte: temperatura inicial 15 min por 35 ^oC com rampa de aquecimento de 60ºC na razão 1^oC min^-1 permanecendo por 20 minutos. Tempo total de corrida 140 minutos.

4.9.1.4. Cromatografia líquida de alta eficiência

A identificação de intermediários durante o processo fotoquímico de degradação foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), no Laboratório de Química de Fitobiomassa (DQ-UFPR). O aparelho utilizado para as análises foi um cromatógrafo Shimadzu LC-10AD e condições adaptadas da literatura (Jankowska et al., 2004; Roig et al., 2003; Ilisz et al., 2002). Foi utilizada uma coluna de fase reversa C-18 (Hypersil) de 15 cm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro e partículas com diâmetro médio de 5 µm. O detector espectrofotométrico (SPD-10A Shimadzu) foi fixado em 225 nm. A fase móvel foi constituída de água Milli-Q e metanol, na proporção de 1:1 v/v, acidificada com H3PO4

0,01%. Curvas de calibração individuais foram elaboradas em todos os casos.

Intermediários que são formados em tempos maiores de reação também foram investigados por cromatografia líquida, utilizando-se cromatógrafo LC-10AD com

amostrador automático SIL 10A, coluna de troca iônica Aminex HPX 87H (300 x 7,8 mm), precedida por pré-coluna Cátion-H, condicionada em forno de aquecimento CTO-10A, com temperatura de 40ºC, e detector espectrofotométrico SPD-M10A, fixado em 230 nm.

Como fase móvel utilizou-se H2SO4 8 mmol L^-1, numa vazão de 0,6 mL min^-1. Para todos os compostos estudados foram realizadas curvas de calibração individuais de cada padrão, a partir de uma solução estoque de concentração de 30 mg L^-1.

4.9.2. Caracterização dos solos

4.9.2.1. Espectrometria de Fluorescência de raios X

A análise de fluorescência de raios X foi realizada no Laboratório de Análise de Minerais e Rochas (LAMIR-UFPR), utilizando-se equipamento Philips modelo PW 2400.

As amostras de solo recebidas “in natura” foram quarteadas, pulverizadas, homogeneizadas, secas a 100 °C e analisadas na forma de pastilha prensada.

A análise de perda ao fogo foi realizada em mufla, ficando as amostras expostas por 3 h a 1000°C.

4.9.2.2. Difração de raios X

Os difratogramas de raios X das amostras de solo em pó foram obtidos em um equipamento SHIMADZU XRD-6000, utilizando-se radiação Cu-Kα (λ-1,5418 nm), voltagem de 40KV e corrente 40 mA.

4.9.3. Outras análises

4.9.3.1. Espectroscopia UV-visível

O acompanhamento do perfil espectrofotométrico de algumas amostras foi realizado em espectrofotômetro Hewlet Packard HP8452A, monitorando-se a região compreendida entre 190 e 820 nm. Todas as medidas foram realizadas em cubetas de quartzo de 1cm de caminho óptico.

4.9.3.2. Espectroscopia de Fluorescência

Análises quantitativas e qualitativas foram realizadas em um espectrofotômetro de fluorescência UV-Vis HITACHI 4500, utilizando-se cubeta de quartzo multifacetada. Dois métodos de análise foram usados: (a) análise direta das amostras em água e (b) análise após extração de hidrocarbonetos em diclorometano. No método (b) as concentrações dos hidrocarbonetos totais da gasolina foram determinadas através de uma curva analítica,

elaborada a partir de uma solução estoque de gasolina em diclorometano.

4.9.3.3. Carbono Orgânico Total

As determinações de carbono orgânico total foram realizadas em um analisador de carbono orgânico total Shimadzu TOC-VCPH, fundamentado na oxidação catalítica de compostos orgânicos a elevadas temperaturas (tubo de combustão a 680 ºC contendo platina suportada em alumina) e detecção de CO2 por espectroscopia no infravermelho.

Curvas de calibração foram preparadas a partir de um padrão de biftalato de potássio, cobrindo-se a faixa de 5 a 100 mg L^-1. Para o carbono inorgânico foi preparada uma curva com um padrão misto de Na2CO3 e NaHCO3, na faixa compreendida entre 5 e 100 mg L^-1. O coeficiente de variação estabelecido para as análises foi de 2%, enquanto que o limite de quantificação foi de 5 mg L^-1 de carbono orgânico.

4.9.3.4. Determinação de compostos fenólicos totais

A determinação de espécies fenólicas foi realizada por espectroscopia UV-Vis, segundo metodologia padrão (APHA-5550B, 1995). O método se fundamenta na reação de oxido-redução entre espécies de caráter fenólico e o reagente de Folin-Ciocalteau (ácidos tungstofosfórico e molibodofosfórico), em tampão carbonato-tartarato, com formação de um complexo com absorção máxima em 700 nm. Fenol foi utilizado como padrão de calibração, obtendo-se curvas lineares na faixa compreendida entre 1 e 80 mgL^-1 e desvios padrão típicos da ordem de 0,5 µgL^-1.

4.9.3.5. Peróxido de Hidrogênio Residual

Os níveis de peróxido de hidrogênio residual foram avaliados espectrometricamente, utilizando uma metodologia modificada a partir de procedimentos descritos na literatura (Oliveira et al., 2001). Neste procedimento, peróxido de hidrogênio reage com vanadato de amônio, o que leva à formação do cátion peroxovanádio que absorve fortemente em 446 nm. Curvas analíticas foram elaboradas com padrão de peróxido de hidrogênio, na faixa compreendida entre 2,5 e 400 mg L^-1. O coeficiente de variação estabelecido para as análises foi de 1 %, enquanto que o limite de quantificação foi de 2,5 mg L^-1.

4.9.3.6. Demanda Química de Oxigênio (DQO)

A DQO corresponde à quantidade de oxigênio consumida na oxidação química da amostra por dicromato de potássio, em meio fortemente ácido, em temperaturas elevadas e na presença de catalisador.

A determinação da DQO foi realizada de acordo com metodologia padrão (APHA-5220D, 1995). O procedimento consiste basicamente na digestão da amostra em tubo fechado seguida de determinação colorimétrica em 600 nm. Curvas de calibração foram elaboradas entre 100 e 600 mg O2 L^-1, utilizando-se padrões de biftalato de potássio. A metodologia foi validada por análise em triplicata de um padrão de biftalato de potássio (300 mg L^-1) observando-se desvios de até 10%, os quais foram considerados satisfatórios (Smith, 1997).

4.9.3.7. Ferro (II) e Fe (III)

As determinações de Fe²⁺ e Fe³⁺ foram realizadas em amostras que sofreram degradação fotoquímica por sistemas Fenton, foto-Fenton e like-Fenton. As análises foram realizadas via espectroscopia UV-vis, utilizando-se metodologia fundamentada na reação de complexação entre Fe²⁺ e o-fenantrolina. O teor de Fe²⁺ é determinado diretamente, enquanto que a concentração de Fe³⁺ é avaliada após redução com hidroquinona. Em ambos casos, íons ferrosos reagem com o-fenantrolina formando um composto intensamente colorido que pode ser medido por espectrofotometria na região do visível (508 nm). As concentrações foram determinadas a partir de uma curva padrão, elaborada com sulfato ferroso amoniacal [Fe(NH4)2(SO4)2.

6 H2O].

4.9.4. Outros procedimentos

4.9.4.1. Eliminação do peróxido de hidrogênio residual por Catalase

Para facilitar o controle analítico das reações Fenton, evitando-se que a reação prosseguisse após a coleta de amostras, o peróxido de hidrogênio residual foi eliminado por tratamento com catalase, seguindo-se procedimentos descritos na literatura (Vázquez, 2002). A catalase é uma enzima normalmente extraída e purificada a partir de tecido hepático bovino e catalisa a decomposição do H2O2 em H2O e O2 (Equação 10).

2H2O2 ^Catalase→ 2H2O + O2 (Eq. 10)

A catalase (Novo Nordisk A/S) utilizada neste trabalho contém 2300 unidades mg^-1, sendo que uma unidade enzimática decompõe 1 µmol de peróxido por minuto.

4.9.4.2. Avaliação de toxicidade crônica

A toxicidade crônica apresentada por amostras contaminadas e submetidas a tratamento foi avaliada por bioensaios, utilizando-se sementes de Lactuca sativa (alface). O procedimento se fundamenta na avaliação da germinação e do crescimento da raiz das sementes, sendo aplicado de acordo com protocolos já estabelecidos (8504200, USEPA 1996).

Em placas de Petri, previamente limpas e secas, foram colocados papéis-filtro de 7,5 cm de diâmetro e 10 mL de amostra ou água deionizada (controle). Em cada uma das placas foram colocadas 10 sementes de alface, de maneira que ficassem bem distribuídas sobre o papel de filtro. Para manter a umidade dentro das placas foram usados pequenos chumaços de algodão, embebidos com água deionizada. Posteriormente, as placas foram cobertas com filme plástico e incubadas no escuro a uma temperatura constante de 24,5°C, por 5 dias. Ao final, foram contadas quantas sementes germinaram em cada placa e foram medidos os comprimentos das raízes em milímetros. Pelo menos 80% das sementes da placa controle devem germinar para que o ensaio possa ser validado; caso contrário, as sementes podem estar velhas ou estocadas de maneira irregular e assim comprometer o resultado do teste. Todas as amostras foram realizadas em triplicata.

Quando foram realizados testes em amostras de solo o procedimento do bioensaio foi baseado na metodologia descrita por Plaza et al. (2005). O procedimento é bastante similar ao descrito anteriormente sendo que, no lugar de solução aquosa, foi adicionado 25 g de solo. Na placa usada para controle, foi colocado 25 g de solo próprio para plantio e água deionizada.