CONTROLE DO PESO DOS ANIMAIS

Os animais foram pesados diariamente por 22 dias (do primeiro dia de privação de sono ao primeiro dia de testes), sendo que os dados relativos ao dia 9 foram desconsiderados por perdas na coleta. Observa-se um curva de ganho de peso dos

animais (Figura 13) em que se observa a ocorrência de diferenças significativas para os fatores tratamento [F(8,61)=2,657; P<0,01], peso [F(20,12)=104,8; P<0,0001] e interação [F(160,12)=1,80; P<0,0001]. P eso ( g ) 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 D M S O P R IV A D O D M S O R E B O T E D M S O C O N T R O L E R E B O T E R O T E N O N A P R IV A D O R O T E N O N A R E B O T E R O T E N O N A C O N T R O L E R E B O T E Z IC A M D M S O C O N T R O L E R O T E N O N A C O N T R O L E 1 2 3 4 5 6 7 8 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 D ia s

FIGURA 13. Peso em gramas dos animais do primeiro dia de privacao ao primeiro dia de teste, o dia 9 foi

desconsiderado. Grupo Zicam n= 7, DMSO Controle n= 7, DMSO privado n=7, DMSO rebote n=7, DMSO Controle Rebote n=7, Rotenona Controle n=7, Rotenona Privado n=7, Rotenona Rebote n=7, Rotenona Controle Rebote n=7. ANOVA de duas vias com medidas repetidas seguido pelo teste post hoc Bonferroni.

5.4 IMUNO-HISTOQUÍMICA PARA TIROSINA HIDROXILASE

A quantificação da densidade de neurônios TH-ir na SNpc (Figura 14), produzida pela neurotoxina rotenona, revelou ter ocorrido uma redução significativa (P<0,001) na densidade desses neurônios no grupo DMSO controle rebote em comparação aos demais grupos experimentais, conforme indicado pelos fatores lesão [F(1,34)=16,32; P=0,0003], privação de sono [F(1,34)=4,29; P=0,04] e interação [F(1,34)=17,98; P=0,0002].

D e n s id a d e n e u r o n a l ( % ) D M S O R O T E N O N A D M S O R O T E N O N A 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 P S T R E B O T E C O N T R O L E R E B O T E # # #

FIGURA 14. Porcentagem da densidade de neurônios TH-ir na SNpc DMSO Controle Rebote (n= 11),

Rotenona Controle Rebote (n=6), DMSO PST Rebote (n=10), Rotenona PST rebote (n=11). ANOVA de duas vias seguido pelo teste post hoc Bonferroni. ###_{P<0,001 vs. DMSO Controle Rebote.}

6 DISCUSSÃO

No presente estudo, observou-se que houve um prejuízo olfatório produzido pelo grupo Zicam, indicando ter havido a inibição da atividade do epitélio olfatório dos animais, produzindo assim um controle positivo para o prejuízo olfatório, tal qual já demonstrado por estudos anteriores de nosso grupo (Rodrigues et al. 2014, Ilkiw et al. 2018). O Zicam promove citotoxicidade ao epitélio olfatório, provavelmente atuando de modo irreversível (Chioca, Antunes, Ferro, Losso, & Andreatini, 2013). Com esta perspectiva, observamos ter ocorrido um prejuízo significativo de desempenho olfatório nos animais do grupo DMSO PST, em comparação ao seu controle não privado de sono, sugerindo ter havido uma associação entre a restrição crônica de sono total e a função olfatória dos ratos. Este resultado se relaciona, de maneira interessante, com outros, recentemente publicados, que demonstraram impactos negativos, advindos do protocolo de restrição de sono, aqui testado, tanto num contexto de geração de efeitos pró-nociceptivos quanto de deterioração de memórias do tipo declarativas (Sardi et al. 2018, Fagotti et al. 2019). Somando-se a essas observacoes, vimos que a lesão dopaminérgica, induzida por rotenona, também foi capaz de gerar semelhante piora na capacidade olfatória dos animais, entretanto, sem ter havido um, até aguardado, sinergismo com a condição de restrição crônica de sono. Porém, destaca-se aqui uma diminuição no tempo de exploração do odor familiar, bem como aumento desse tempo, para o odor não familiar, apenas no grupo rotenona PST, em comparação ao grupo DMSO controle, sugerindo algum grau de prejuízo olfatório, mais evidenciado por este grupo. Em complementação, descrevemos recentemente que a privação aguda de sono REM pôde produzir efeitos olfatórios compensatórios, quantificados pela mesma tarefa aqui testada, mediante a

lesão da via nigroestriatal induzida por rotenona (Rodrigues et al. 2019). Observou-se também que nenhuma das manipulações realizadas impactou negativamente no crescente ganho de peso dos animais ao longo dos dias de experimento, afastando assim a influência de outros fatores relacionados à sobrevivência dos animais quanto aos parâmetros avaliados.

A análise do desempenho olfatório após o período de sono rebote revelou ter havido uma restauração dessa função em todos os grupos experimentais testados, haja vista ter ocorrido uma significativa discriminação entre os odores apresentados na tarefa. Dessa forma, é plausível pensar que a reversibilidade dos efeitos advindos da restrição crônica de sono possam se dar, em parte, pelo mecanismo de supersensibilidade dopaminérgica (Tufik et al. 1978, Tufik 1981, Nunes et al. 1994, Lima et al. 2008b), classicamente descrito após eventos de privação de sono REM, podendo assim impactar em tarefas dependentes do sistema dopaminérgico. Como já descrito na literatura, a olfação apresenta uma dependência bastante singular da neurotransmissão dopaminérgica nas sinapses glomerulares, principalmente frente ao seu papel inibitório (associado à ativação do receptor D2), portanto, regulando a ativação sináptica à jusante na via olfatória principal (Hoglinger et al. 2015). Deste modo, é possível propor que a restrição crônica de sono, por nós testada, poderia gerar um crescente déficit de sono REM, ao longo dos dias de restrição, produzindo algum grau de supersensibilidade D2 que se expressaria numa piora olfatória, podendo ser restaurada pelo sono rebote.

Além disso, a administração de um agonista D2, piribedil, associado com a supersensibilidade D2, aumenta o efeito inibitório gerado pelos receptores D2, e, portanto, promovendo déficit olfatório (Rodrigues et al., 2014). Quando os receptores D2

estão ativados, a capacidade de discriminar odores é reduzida por alterar a sensibilidade de neurônios bulbares. Pela administração de agonistas e antagonistas de receptores D1 e D2, é sugerida que, primordialmente, é a modulação do receptor D2, e não de D1, que impacta na tarefa de discriminação de olfatória (Escanilla, Yuhas, Marzan, & Linster, 2009).

Em contrapartida, a restauração do desempenho olfatório, após o rebote, no grupo submetido apenas à lesão dopaminérgica, não pode ser, satisfatoriamente, explicada por essa hipótese, uma vez que a lesão, tal como já descrevemos em outras oportunidades, é um processo perene e de impactos bastante amplos (Lima et al. 2006, Lima et al. 2007, Moreira et al. 2012) embora, por vezes, compensados plasticamente pelos neurônios remanescentes (Ilkiw et al. 2018, Targa et al. 2018, Rodrigues et al. 2019). Por outro lado, os resultados da avaliação histológica não conseguiram observar reduções na densidade dos neurônios TH-ir presentes na SNpc dos animais submetidos à neurotoxina rotenona, tornando qualquer discussão baseada num efeito olfatório compensatório, pelos neurônios ainda presentes, meramente especulativa. Entretanto, cabe aqui uma ressalva metodológica que põe em xeque a reprodutibilidade dos dados histológicos produzidos. Verificou-se que os cortes obtidos a partir de coordenadas para o mesencéfalo, incluindo a SNpc, não foram homogeneamente coletados de forma a produzir uma reconstrução representativa da área de interesse. Portanto, será necessária a realização de uma replicação desse experimento de quantificação de extensão da lesão, haja vista que o processo cirúrgico utilizado é altamente padronizado, tendo sido reproduzido, inclusive com resultados histológicos de lesão de 40-50% dos neurônios TH-ir, em muitos outros trabalhos de nosso grupo (Lima et al. 2006, Lima et

al. 2007, Reksidler et al. 2007, Lima et al. 2008a, Lima et al. 2012, Dos Santos et al. 2013, Noseda et al. 2014, Rodrigues et al. 2014, Targa et al. 2016, Ilkiw et al. 2018, Targa et al. 2018, Fagotti et al. 2019, Ilkiw and Lima 2019, Rodrigues et al. 2019).

Outro ponto relevante para reflexão diz respeito ao próprio protocolo do teste olfatório utilizado em que é conduzido apenas um treinamento de 2 minutos com os animais. Tong e colaboradores (2014) levantaram a hipótese de que tarefas de discriminação olfatória com métricas relativamente não intuitivas como odor específico do lado direito ou esquerdo, como foi realizado em nosso experimento, necessite de centenas de treinamentos, enquanto tarefas com métricas mais intuitivas para o animal, como cavar por sinais de odores, requer menos do que 20 treinamentos para atingir o objetivo (Tong, Peace, Cleland, & Harley, 2014). Com isso, não podemos descartar uma eventual limitação do método utilizado, sendo salutar a necessidade de constante aperfeiçoamento, que por sua vez é foco de padronização em outro projeto em andamento em nosso laboratório.

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

- Observamos que animais com lesão intranigral por rotenona apresentaram prejuízo olfatório na TDO. Os animais lesionados que passaram pelo processo de

restrição crônica de sono tiveram um menor tempo de exploração do odor familiar, em comparação ao grupo controle sem lesão, evienciando um intenso prejuízo olfatório. Entretanto, não correu sinergismo entre lesão e a restrição crônica de sono.

- Os animais controle do grupo restrição crônica de sono, apresentaram um prejuízo olfatório significativo, sugerindo uma associação entre a privação de sono e o desempenho olfatório. Provavelmente a restrição promova uma supersensibilidade de receptores D2, de natureza inibitória, responsáveis pela neurotransmissão dopaminergica nas sinapses glomerulares.

- O sono rebote restaurou a função olfatória de todos os grupos. Contudo, devido a coleta histológica não homegenea, não foi possivel observar a redução na densidade de neuronios TH-ir em nenhum dos grupos tratados com rotenona, tornando qualquer discussão baseada num efeito olfatório compensatório, pelos neurônios ainda presentes, meramente especulativa.

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