5.5.1 Curva Padrão
Para o cálculo da concentração dos analitos foi plotada uma curva de regressão linear entre as concentrações conhecidas do analito em questão (eixo X) e sua absorvancia após a realização do ensaio bioquímico (eixo Y). A Tabela 12 mostra a curva de regressão linear obtida para cada analito. A curva padrão de todos os analitos apresentou uma boa correlação (r), variando entre 0,94 e 0,99.
Tabela 12 – Valor do r da correlação entre a absorbância e a concentração de cada analito
Analito r (P) Equação de regressão
Colesterol Total 0,999 (NS) ABS = 0,000785*[CT] + 0,0515
HDL Colesterol 0,972 (NS) ABS = 0,001098*[HDL] + 0,1570
LDL Colesterol 0,984 (NS) ABS = 0,002508*[LDL] - 0,1195
Triglicerídeo 0,997 (NS) ABS = 0,0004057*[TG] + 0,0160
TGO 0,943 (NS) ABS = 0,001135*[TGO] + 0,2065 TGP 0,970 (NS) ABS = 0,001489*[TGP] + 0,2083
Fosfatase alcalina 0,948 (NS) ABS = 0,05274*[FA] - 0,6340
Abreviaturas: NS, não significativo; ABS, absorbância da amostra; CT, colesterol total; HDL, lipoproteína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa densidade; TG, triglicerídeos; TGO, transaminase glutâmico oxalacética; TGP, transaminase glutâmico pirúvica; FA, fosfatase alcalina.
5.5.2 Controles de Qualidade
Na Tabela 13 são apresentados os valores observados dos diferentes analitos sanguíneos, após a realização dos diferentes ensaios bioquímicos. Os valores observados de CT, FA e TGO, tanto para o controle normal quanto para o patológico se encontram foram do esperado segundo a bula dos controles de qualidade. Os valores do controle normal de LDL e TG também se encontram fora do esperado, assim como o valor do controle patológico de TG. Porém, apesar de fora do esperado, os valores do controle normal de TGP e FA são observados bem próximo ao esperado. Foram observados valores dentro do que se espera segundo a bula para os controles normais de HDL e TG e para os controles patológios de HDL, LDL, TG e TGP.
Tabela 13 – Concentração observada dos diferentes analitos presentes no controle normal e controle patológico utilizados nos ensaios bioquímicos
Analito Controle Normal Controle Patológico
Colesterol Total 73,91 mg/dL 248,67 mg/dL
HDL Colesterol 49,8 mg/dL 91,1 mg/dL
LDL Colesterol 8,6 mg/dL 73,9 mg/dL
Triglicerídeo 49,4 mg/dL 377,6 mg/dL
TGO 79,6 U/mL 186,0 U/mL
TGP 15,7 U/mL 118,4 U/mL
Fosfatase alcalina 37,14 U/L 47,31 U/L
Abreviaturas: HDL, lipoproteína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa densidade; TGO, transaminase glutâmico oxalacética; TGP, transaminase glutâmico pirúvica.
6 DISCUSSÃO
Dietas ricas em gordura saturada são um importante fator para o desenvolvimento da aterosclerose, por causar distúrbios lipídicos, principalmente o aumento do LDL (Steinberg et al., 1989; Sposito et al., 2007; Henning et al., 2016). Apesar dessa informação ser amplamente difundida, o consumo desse tipo de dieta, que juntamente com o consumo de sódio e carboidratos simples é chamada de dieta ocidental, se faz muito presente na sociedade moderna.
No presente estudo, para avaliar as consequências iniciais da ingestão desse tipo de dieta, foi utilizada uma dieta rica em gordura (15%), colesterol (1,25%) e ácido cólico (0,5%). Estudos mostram que esse tipo de dieta é capaz de induzir, após em torno de 12 semanas de ingestão, estágios iniciais de aterosclerose em algumas linhagens de camundongos como o C57BL/6, apesar de camundongos serem relativamente resistentes ao desenvolvimento da aterosclerose (Paigen et al., 1985; Nishina et al., 1990; Breslow, 1996). Tal dieta se mostra eficiente para esse fim porque a ingestão de ácido cólico aumenta a absorção intestinal de gordura e colesterol, assim como inibe a conversão de colesterol em ácido biliar, diminuindo ao final a eliminação do colesterol absorvido (Ando et al., 2005). Além disso, o tipo de gordura saturada presente na dieta é oriunda da banha de porco, sendo o tipo de gordura mais recomendada para induzir a obesidade e roedores (Buettner et al., 2006). Diante disso, a dieta utilizada no presente estudo se mostrou eficaz em modificar parâmetros lipídicos e marcadores de função hepática.
Observou-se, em nosso estudo, que os animais do grupo experimental que receberam dieta aterogênica apresentaram uma ingestão alimentar menor do que os animais alimentados com dieta controle. Apesar disso, o consumo de energia do grupo alimentado com dieta aterogênica foi estatisticamente maior nos grupos de 2 e 4 semanas. Este fato justifica-se pela densidade energética da dieta aterogênica ser consideravelmente maior do que a da dieta controle (5,000 kcal/g vs 3,804 kcal/g respectivamente). Tal dado é importante, já que o aumento do consumo energético é indispensável para o aumento da adiposidade (Townsend et al., 2008).
Apesar da maior ingesta calórica, não foi observado o aumento da MC dos animais, quando comparados os grupos alimentados com dieta controle e dieta aterogênica. Isso mostra que a ingestão da dieta aterogênica não foi capaz de aumentar a MC de camundongos C57Bl/6 alimentados por oito semanas. Esse dado pode ser considerado consistente com a literatura, à medida que Nishina e colaboradores, em seu estudo, também não observaram aumento de MC com a utilização de dieta semelhante (Nishina et al., 1990).
Sabe-se que as deslipidemias estão intimamente relacionadas com o processo de aterogênese. A partir da utilização de uma dieta aterogênica, se pode observar o aumento nos níveis de CT, o que mostra que a dieta em questão foi eficaz em induzir uma deslipidemia nos camundongos. No estudo de Srivastava e colaboradores, tal alteração também foi observada (Srivastava et al., 2000). Diversos estudos mostram que uma dieta rica em gordura saturada e rica em ácido cólico aumenta os níveis séricos de LDL e diminui os níveis séricos de HDL (Nishina et al., 1990; Ishida et al., 1991; Srivastava et al., 2000). Tal dado não foi consistente com o presente estudo já que foi observado um aumento tanto de LDL, quanto do HDL, de forma bastante significativa.
Em relação aos triglicerídeos, não foram observadas alterações entre os animais alimentados com dieta controle e aterogênica. Corroborando com esse estudo, Ishida e colaboradores também não encontraram diferença na concentração de tal analito em camundongos alimentados com dieta aterogênica (Ishida et al., 1991). Já Srivastava e colaboradores observaram um aumento significativo no triglicerídeo de camundongos alimentados com dieta rica em lipídeos e ácido cólico quando comparado a uma dieta convencional (controle), porém não encontraram tal diferença quando comparada a alimentação com dieta aterogênica e alimentação com dieta rica em lipídeos sem a adição de ácido cólico (Srivastava et al., 2000).
O monitoramento de enzimas hepáticas é fundamental com a utilização desse tipo de dieta, já que a lesão hepática é uma das manifestações da Sindrome Metabólica na qual esse tipo de dieta é um fator de risco conhecido (Soler et al., 2008; Schild et al., 2013). Em nosso estudo, foi observado um aumento significativo nos níveis da enzima TGP, considerada a enzima mais
específica para a caracterização de doença hepática, uma vez que ela está presente em maior quantidade no citosol do hepatócito do que em outros tecidos. Esse nível aumentado está de acordo com a literatura já que Nishida e colaboradores também observaram em seu estudo um aumento considerável dos níveis séricos desse marcador em camundongos C57BL/6 alimentados com dieta aterogênica até a 14ª semana (Nishina et al., 1990).
Geralmente, os níveis das enzimas TGO e TGP aumentam em conjunto e a relaçao entre ambos é importante na avaliação da gravidade da lesão hepática (Ozer et al., 2008; Al-Busafi et al., 2013). No presente estudo, houve aumento dos níveis séricos da enzima TGO na 2ª e na 4ª semana de estudo, porém esse aumento não foi observado na 8ª semana. Todavia, numa análise mais ampla, esse tipo de dieta foi capaz de alterar os níveis séricos dessas enzimas, indicando que houve lesão hepática a nível de hepatócitos.
Além da lesão à nível celular, estudos mostram que a presença de ácido cólico na dieta experimental é capaz de induzir a formação de cálculos biliares até a 14ª semana (Nishina et al., 1990; Khanuja et al., 1995). Como a enzima fosfatase alcalina está presente nas células de ductos biliares, seu aumento normalmente se faz presente na presença de cálculos biliares já que, nesse caso, há obstrução desses ductos. No presente estudo, não foi observado aumento dos níveis séricos de fosfatase alcalina, mostrando que o tempo de administração de dieta não foi suficiente para alterar tal parâmetro.
Por fim, a partir desse estudo, pode-se observar que a avaliação do perfil lipídico e de marcadores de função hepática por método bioquímico colorimétrico adaptado para a realização em microplaca de 96 poços foi eficiente. Os ensaios forneceram uma boa curva padrão dos analitos com a utilização de pequenas quantidades de reagentes e amostras, o que é importante, visto a dificuldade na obtenção de grandes quantidades de soro em estudos feitos em camundongos. Em média, consegue-se obter após punção cardíaca e centrifugação do sangue, cerca de 300 a 400 µL de soro ou plasma, dependendo da linhagem, gênero e idade do camundongo. Esse volume é considerado pequeno, quando se quer realizar a dosagem de diversos analitos
em um soro ou plasma proveniente de um mesmo animal para estudos metabólicos.
A curva de regressão linear plotada para o cálculo da concentração dos analitos apresentou uma boa correlação, onde o r variou entre 0,94 e 0,99. Entretanto, os controles normal e patológico utilizados nos diversos ensaios não atingiram os valores esperados para diversos analitos. Acreditamos que os controles utilizados no presente ensaio não são confiáveis para todos os analitos, necessitando-se buscar dessa forma controles de novos fornecedores que sejam de qualidade e confiabilidade para a realização de ensaios futuros.
7 CONCLUSÃO
Uma dieta hiperlipídica rica em colesterol e ácido cólico é capaz de alterar o metabolismo lipídico e hepático, mesmo sem o ganho de massa corporal e sem ser necessário um tempo prolongado de exposição à dieta, em camundongos C57Bl/6. Entretanto, esta mesma dieta não é capaz de alterar os níveis de fosfatase alcalina, indicando que até a oitava semana de exposição não haveria o risco de colestase e doença hepática obstrutiva neste modelo animal.
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